[发明专利]一种安宁铗蠓的特异基因及其分子鉴定方法

说明书

本发明公开一种安宁铗蠓的特异基因及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学方法获取该铗蠓的28S rDNA基因序列，通过基因序列相似性的比对，对该铗蠓进行种类鉴定。本发明提供的安宁铗蠓分子鉴定方法，有利于实现安宁铗蠓准确、快速的鉴定。

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及安宁铗蠓的特异基因序列及其分子鉴定方法。

背景技术

蠓类是双翅目中的微小型昆虫，俗称小咬。目前，对蠓类的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

分子鉴定技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家们的重视。近年来，随着以PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA（rDNA）和线粒体DNA（mtDNA）等基因逐渐受到重视，并在吸血蠓的分子鉴定中得到广泛应用。该技术与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等问题，而且可实现吸血蠓的快速鉴定。本发明提供的安宁铗蠓特异基因序列有利于实现安宁铗蠓的快速鉴定，缩短鉴定时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安宁铗蠓的特异基因序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学方法获取安宁铗蠓（Forcipomyia anningensis）特异基因—28S rDNA基因序列，通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地鉴定安宁铗蠓。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

采用小型昆虫微量DNA 模板制备方法，通过改进的PCR 反应条件，由合成的引物扩增安宁铗蠓的28S rDNA基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI 中进行Blast 相似性搜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的安宁铗蠓特异基因，为28S rDNA基因，所述铗蠓的28S rDNA基因序列如SEQ ID No.1 所示（不含引物）：

本发明所述的安宁铗蠓28S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：

正向引物 5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT 3’

反向引物 5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT 3’。

本发明所述的安宁铗蠓的分子鉴定方法，包括：

1）从待测的昆虫组织中分离提取DNA；

2）以该DNA为模板，采用的引物为：正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT 3’，反向引物5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT 3’，通过聚合酶链式反应扩增出该昆虫的28S rDNA基因；

3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的28S rDNA基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果。若能相应地特异性扩增出大小约为819 bp的条带，送生物公司测序；

4）根据测序结果，若目标基因序列与SEQ ID No.1的相似性均在98%以上，即可判断所述的待测组织即为安宁铗蠓。

安宁铗蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结果的可靠性。

所述引物根据文献合成，正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT 3’，反向引物5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT 3’。