[发明专利]B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用

说明书

本发明提供了B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用，解决了现有淋巴细胞无血清培养基在没有任何血清替代添加剂的情况下，淋巴细胞的体外扩增缓慢、难以满足临床细胞治疗所需要的细胞数量的问题。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，更具体地涉及B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用。

背景技术

近年来，随着免疫治疗技术的飞速发展，以淋巴细胞为基础的各类细胞免疫治疗已经成为人们日益关注的焦点。以淋巴细胞技术以及经过基因工程技术修饰的各类淋巴细胞为载体的免疫治疗技术已经成为抗肿瘤治疗强有效的手段，在针对难治复发白血病病人的临床治疗试验中显示出突出的疗效。然而淋巴细胞免疫治疗作用的发挥依赖于足够数量的淋巴细胞，这使得淋巴细胞的体外有效扩增成为所有细胞免疫治疗的技术关键。

由体内提取出的淋巴细胞需要通过一定的方式使其激活和在特定的细胞因子作用下转化成具有活性、增殖和特异性杀伤能力的淋巴细胞。目前淋巴细胞都是在添加人源或动物源血清的条件下进行体外培养和增殖。血清作为传统淋巴细胞扩增的主要添加剂之一，对淋巴细胞扩增的质量至关重要。然而，无论人源血清还是动物源血清都具一定的安全疑虑，例如，病源、排斥或过敏，从而不适合临床应用。同时这也增加了体外扩增自体淋巴细胞的质量检测和监控的难度。正是由于上述缺点，无血清或化学限定的培养基已逐渐成为细胞生产和临床应用细胞体外培养的必须培养基。化学成分明确的培养基是由一系列高质量、高纯度的有机化合物和无机化合物共同组成的培养基。无血清培养基和化学成分明确的培养基的应用对细胞体外生产的工艺及终点细胞产品质量控制至关重要。

目前市场上多家厂商都相继开发出了适用于淋巴细胞体外培养的无血清培养基，如Gibco公司的AIM-V、Sigma公司的Stemline、Takara公司的GT-T551H3、Miltenyi公司的TexMACS等。虽然这些淋巴细胞培养基标注为无血清培养基或者化学成分明确的无血清培养基，但是在没有任何血清替代添加剂的情况下，淋巴细胞的增殖仍然缓慢，难以满足临床细胞治疗所需要的细胞数量。Lonza公司的X-VIVO 15是研制开发用于淋巴细胞体外扩增的无血清培养基。该培养基在不添加其他血清及替代添加剂的培养条件下，淋巴细胞体外增殖的效果优于其他品牌的无血清培养基。但是，与添加血清的培养条件相比，增殖效果仍然差距较大。

市售的B-27添加剂(也简称B27)作为无血清添加剂，目前已知用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性，其使用浓度为2％，在低于2％浓度时培养细胞的效果不佳。目前，对于B-27添加剂是否适用于其他细胞系、是否可以使用更低浓度培养细胞均未见报道。

本发明以市售胎牛血清为参比物，在各种市售的淋巴细胞无血清培养基中添加不同比例的细胞培养添加剂B27添加剂进行体外增殖的对比研究，并考察不同的激活方式对细胞增殖的影响以筛选出能够替代血清用于体外有效扩增淋巴细胞的市售细胞培养添加剂，并寻找其更低的使用浓度以降低成本，用于淋巴细胞的体外增殖生产工艺的开发，以促进细胞免疫治疗的产业化。

发明内容

鉴于现有淋巴细胞无血清培养基在没有任何血清替代添加剂的情况下，淋巴细胞的体外扩增缓慢，难以满足临床细胞治疗所需要的细胞数量，本发明的目的在于提供B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的新应用。

本发明的B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用以提高现有淋巴细胞无血清培养基的体外扩增效率的同时，保持淋巴细胞活性，并由此提供了适用于人类细胞治疗应用的无血清的淋巴细胞体外扩增培养基。

本发明的一个方面提供了B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用。

其中，所述B27添加剂的体积浓度为0.20-4％，优选地为0.25-1.75％，更优选地为0.25-1.5％。