[发明专利]柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测引物组，其特征在于：包括外引物ApNPV-F3、外引物ApNPV-B3、内引物ApNPV-FIP和内引物ApNPV-BIP，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物ApNPV-F3：CGAGTCACGCGCTTTAGC（SEQIDNO:1）

外引物ApNPV-B3：TGGCTGTCTAGCTGGTTCT（SEQIDNO:2）

内引物ApNPV-FIP：GAACCGCTTTGCATTCGAGCTGTCAACACAAAGCCGACATGG（SEQIDNO:3）

内引物ApNPV-BIP：AGCGCAAATAGAAACGCGCAAAGCAATTTGTCGTAAGCCGC（SEQIDNO:4）。

2.柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由权利要求1的外引物ApNPV-F3、外引物ApNPV-B3、内引物ApNPV-FIP和内引物ApNPV-BIP配制的检测引物溶液浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L；

（2）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；

（3）10X反应缓冲液：200mmol/LTris-HClpH8.8；100mmol/LKCl；100mmol/L(NH₄)₂SO₄；40~100mmol/LMgSO₄；6~14mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（5）显色剂：1000XSYBRGREENI荧光染料。

3.根据权利要求2所述柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的检测引物溶液中含有5μmol/L外引物ApNPV-F3、5μmol/L外引物ApNPV-B3、40μmol/L内引物ApNPV-FIP、40μmol/L内引物ApNPV-BIP。

4.根据权利要求2所述柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL。

5.根据权利要求2所述柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10X反应缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L、8mol/L。

6.根据权利要求2~5任意一项权利要求所述柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：柞蚕核型多角体病毒的LAMP检测方法，包含以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10X反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；

（3）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育15~25min，80℃孵育5min终止反应；

（4）LAMP扩增结果鉴定：在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。