[发明专利]一种大肠杆菌重组表达结核分枝杆菌Rv2837c活性蛋白的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种大肠杆菌重组表达结核分枝杆菌Rv2837c活性蛋白的方法及其应用。将结核分枝杆菌Rv2837c蛋白基因克隆入原核表达载体pET28a+，命名为pET‑CnpB。采用Ni离子亲和层析法获得纯化的Rv2837c活性蛋白。重组Rv2837c蛋白可用于检测结核分枝杆菌感染动物和病人血清。重组Rv2837c蛋白可诱导小鼠高水平的体液和细胞免疫应答，可用于结核病新型亚单位疫苗的研制。因此，Rv2837c蛋白具有良好的应用前景。本发明涉及该活性重组蛋白在制备结核病诊断和预防制剂或药物中的应用。

技术领域

本发明属于结核诊断试剂和疫苗领域。本发明涉及一种大肠杆菌重组表达并获得结核分枝杆菌Rv2837c活性蛋白的方法。本发明还涉及该重组蛋白在制备结核病诊断和预防制剂或药物中的应用。

背景技术

结核病流行现状

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的慢性传染病，目前仍然是全世界范围内危害最严重的传染病。据WHO报告，全世界已有约1/3人口感染结核分枝杆菌，2013年新发患者约900万，在所有传染病中结核病死亡率仅次于艾滋病。WHO将TB与艾滋病、疟疾一起列为人类最主要的传染性杀手。我国属于全球22个TB高负担国家之一，在我国27种法定报告传染病中排第一位。我国卫生部将TB列为全国重点控制的重大疾病之一，国家“十一五”和“十二五”重大传染病专项课题均将结核病列为重点研究对象之一。

结核病诊断研究现状

显微镜镜检、痰培养是病原体检测的主要手段，但以病原体的检出为基础的诊断方法存在实验周期长、敏感度低、特异性不理想以及耗时长等缺点。分子生物学方法如PCR、杂交和基因和蛋白芯片也已应用于结核病的快速诊断，但因其检出率不理想，且存在技术要求高、价格昂贵等原因，不适用于临床大规模筛选。积极研究新型的诊断方法和试剂有助于结核病的控制。

免疫学技术的迅猛发展促进了诊断技术的发展。人类感染结核分枝杆菌后，产生免疫力的同时发生迟发型超敏反应。结核菌素试验是通过测定机体对结核分枝杆菌有无超敏反应，判定受试者是否具有抗结核分枝杆菌的细胞免疫，以判断受试者是否感染该病原菌的一种方法。以此原理研制的结核菌素试验(PPD)目前仍在临床广泛使用，但是由于卡介苗的广泛接种，结核菌素试验结果阳性并不能诊断为结核病，而更多用于疫苗效果监测。

结核感染后，体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞，当再次遇到抗原刺激时，能迅速活化增殖，产生多种细胞因子，其中IFN-γ是关键的细胞因子。IFN-γ释放试验(interferon gamma release assay，IGRAs)是一种用于结核分枝杆菌感染的体外免疫检测的新方法，在在鉴别活动性结核和潜伏结核感染、预测结核发病风险方面具有一定意义，但对临床结核诊断价值比较局限，此外，T-SPOT.TB试验技术操作要求高，试剂盒价格昂贵，也限制了其在经济水平不高的国家和地区的应用。

血清学诊断通过检测感染者血清结核特异性抗体水平，间接诊断结核病，具有特异性好、耗时短和易于批量检测的显著优势。目前选用结核分枝杆菌与卡介苗基因组差异区抗原，采用ELISA等方法检测患者血清中特异性抗体进行辅助诊断的研究，研究比较深入的如早期分泌抗原靶6kD蛋白(early secretary antigenic target 6ku protein，ESAT-6)、培养滤液蛋白(culture filtrate protein，CFP-10)、脂阿拉伯甘露聚糖抗原、Ag85复合物、38KD蛋白、A60抗原、16KD蛋白、MPT64、MTB48等。这些抗原各具特点，虽然国内外多种结核血清学诊断试剂盒上市，但是其临床报告结果不一，因此继续筛序与疾病相关的特异抗原，组合已有的优势抗原，有助于开发出更有效的血清学诊断方法。

结核病亚单位疫苗研究现状