[发明专利]一种高抗霉活性抗菌脂肽V7-surfactin的制备方法

权利要求书

1.一种高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，其特征在于，以纳豆芽孢杆菌为菌种，用固态发酵法制取高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin；

V₇-surfactin的结构简式为：Cyclo（C₁₄BOHFA-E₁-I/L₂-I/L₃-V₄-D₅-I/L₆-V₇）；

包括以下步骤：

（1）纳豆芽孢杆菌种子液的制备；

（2）按照以下配方制备发酵培养基：葡萄糖20-40g，酵母浸出粉1-5g，大豆蛋白胨4-6g，Na₂HPO₄ 1-2g，KH₂PO₄ 0.5-1.5g，丙氨酸0.2-0.6g，谷氨酸0.2-0.8g，天冬氨酸0.2-0.8g，缬氨酸0.2-4.0g，琼脂粉15-20g，水1L；pH 6.3-6.8，121℃灭菌20-30min，得发酵培养基；

（3）接种、发酵：将步骤（2）所得发酵培养基冷却至45-50℃，在无菌条件下将培养基倒入无菌的培养皿中，培养基厚度控制在2-3mm；静置5-10min，待培养基凝固后，按照0.02-0.08mL种子液/9cm直径培养皿的接种量接入步骤（1）所得纳豆芽孢杆菌种子液，并用无菌的涂布棒将种子液在培养基表面涂布均匀；再置于28-35℃，相对湿度70-85%条件下发酵培养48-96h；

V₇-surfactin的提纯步骤：

（4）V₇-surfactin的提取：发酵结束后，将体积浓度为90-100%的甲醇按照4-5mL甲醇/9cm直径培养皿的量喷入培养物表面，常温下浸提3-5min；重复浸提操作2-3次，合并各次浸提液；将浸提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10-1/5，得提取浓缩液；

（5）V₇-surfactin的制备：将步骤（4）所得提取浓缩液过0.22μm或0.45μm滤膜或经固相萃取预处理，再用制备型HPLC分离。

2.根据权利要求1所述的高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，其特征在于，HPLC条件为：粒径2.7-5μm的C18或C8制备柱，紫外检测器，检测波长为210或215nm；流动相A为水，B为乙腈或甲醇或两者混合液，洗脱梯度为5-95%，洗脱时间20-60min；收集对应峰值的洗脱物，旋转蒸发去除有机溶剂，40-50℃条件下低温干燥至恒重，得到白色固体，即为V₇-surfactin。

3.根据权利要求1所述的高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，固相萃取采用C18固相萃取柱。

4.根据权利要求2所述的高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，固相萃取采用C18固相萃取柱。