[发明专利]自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法

权利要求书

1.一种自然杀伤细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括：通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发自然杀伤细胞脱颗粒，再用流式细胞术检测自然杀伤细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a阳性的细胞占总自然杀伤细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度来评价其脱颗粒能力；

所述的检测方法具体包括以下步骤：

1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至1.8～2.2×10⁶/ml；

2)、取自然杀伤细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度至1.8～2.2×10⁶/ml，所述自然杀伤细胞天然靶细胞为K562细胞或P815细胞；

3)、将步骤1)中的所述外周血单个核细胞和步骤2)中的所述自然杀伤细胞天然靶细胞按体积等比混合，得到细胞混合液；将所述细胞混合液于37℃，5％CO₂培养箱中共孵育2.5～3.5h后离心并弃上清，得到沉淀；

当所述自然杀伤细胞天然靶细胞为P815细胞时，孵育之前还需要在所述细胞混合液中加入抗人CD16抗体；所述抗人CD16的抗体浓度为0.25～0.5μg/100μl；

4)、加入流式染色缓冲液重悬步骤3)中所述沉淀，同时加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗体并孵育；

在步骤4)中，CD3、CD56的抗体的浓度为0.45～1.0μg/100μl；CD107a的抗体浓度为0.06～0.125μg/100μl

5)、待孵育完成后离心，用流式染色缓冲液洗涤沉淀；

6)、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测；

7)、统计CD3-CD56+CD107a+的细胞占CD3-CD56+细胞的比例在激发脱颗粒前后的变化幅度用以评价自然杀伤细胞脱颗粒能力。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤4)中，孵育条件为：

室温避光孵育15～25min。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流式染色缓冲液的配方为：

含有2.0％FBS和2.0mM EDTA的1×PBS溶液。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤2)、步骤3)和步骤5)中，所述离心的转速均为1200～1600rpm，离心时间均为4～6min。