[发明专利]一种多聚体酶‑抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，特别是涉及一种多聚体酶-抗体及其制备方法。

背景技术

免疫组织化学是一种利用抗原与抗体特异性识别的特征进行对病理标本中肿瘤特异性蛋白或抗原检测的免疫组织化学技术[1、2]。这个技术不仅能够检测到特征物质的性质和量，更因为这种技术能够特征蛋白或抗原原本的位置上并在保持组织原有形态的基础上进行检测，使之成为对病理病因分析(尤其是对肿瘤病理的分析)最为有效的方法，已成为肿瘤诊断、鉴定、鉴别和疗效预测等最为普遍使用的临床方法之一。

免疫组织化学的实验操作步骤和原理是[2、3]：1)通过外科手术获取病理标本(肿瘤组织或其它病灶组织)，经过福玛琳固定，酒精脱水，石蜡包埋后，切片成3-5微米厚度的组织切片，粘附在玻片上。2)经过有机溶剂脱蜡，酒精清洗和水化后，再经过高温烹煮使组织上的特征物质(比如肿瘤特征蛋白或抗原，或病原体蛋白)回复原有形状。3)经过使用特异性抗体(具有与特征物质或与特异性抗原结合能力的抗体，称之为“一抗”)对特征蛋白的识别。4)经过使用标记酶标记的抗一抗的抗体(称之为“二抗”)的孵育，使酶标记的二抗与一抗结合，确定特异性特征物质(蛋白)的位置。5)使用显色剂在标记酶的催化下起化学反应，形成不溶性有色化合物在原位上沉淀下来，从而显示酶标二抗所存在的位置(也就是特征蛋白或抗原所在的位置。6)使用苏木素把整个组织形态衬染出来以便于对组织形态的识别。7)经过这样一个系列的操作过程， 使肿瘤特征蛋白或病原体蛋白所存在的位置和量通过颜色的位置和深浅显示出来，起到鉴定和鉴别的作用，指导临床治疗。

免疫组织化学整个试验操作过程需要近三十个步骤[3、4]，包括：脱蜡、水化、内源性酶阻断、清洗、高温热修复、冷却、清洗、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、增效剂孵育、清洗、显色、清洗、衬染、清洗、脱水、封片等步骤。这些步骤中除了需要规范的组织取样和预处理外，影响切片标本处理效果的关键因素一是一抗的特异性和亲和力，二是二抗的信号放大效果。而二抗的放大能力取决于二抗的特异性和亲和力以及二抗上所标联的标记酶的数量。现有技术的原理及其缺点:目前市场常用的标记酶标联的二抗其工作原理有以下三种方法：a)使用生物素-亲生物素放大法[1](图1)。此方法的原理是：在二抗上使用生物素标记，然后把标记酶与亲生物素标联[2]。在切片标本的处理过程中，在标本上滴加一抗之后，滴加生物素标记的二抗，接着再滴加与标记酶标联的亲生物素。利用亲生物素与生物素之间的特异高亲和力，使与亲生物素标联的标记酶定位在特征物质所在的位置上。此方法的优点在于生物素是个有机小分子，因为体积小可以在二抗上较多地标记而较少影响二抗的特异性和亲和力。在二抗上标记的生物素量多，就有可能与更多的标记酶标联的亲生物素结合，可以提高信号放大的效果，提高检测灵敏度。然而，此方法存在一个严重的缺点是：生物素是生物体内存在的维生素之一，尤其在小肠组织，肾组织，脑组织和肝组织中普遍存在，使用生物素－亲生物素放大法在上述组织中会出现与检测本身无关的阳性信号，即出现假阳性的误诊可能。此方法的另一个缺点是需要多出一个操作步骤。b)直接酶-二抗标联法[2](图2)。此方法便是把标记酶通过有机小分子偶联试剂直接标联在二抗上。由于标记酶本身分子量较大(常用的过氧化酶分子量为40，000Da，碱性磷酸酶分子量为140，000Da， 尿素酶分子量为200，000Da)，体积较大，只能在二抗分子上标联1-2个酶分子，标联多了便会降低二抗本身的特异性(降低特异性便会引起高背景和非特异性信号)以及降低二抗的亲和力，降低了其检测的灵敏度。c)多聚体酶-二抗标联法。这是近一些年来新型的标记酶与二抗的标联方法(图3)[5，6]。为了减少标记酶对二抗特异性和亲和力的损害，不直接将标记酶标联到二抗分子上，而是将标记酶首先链接到一个链状的有机高分子上(比如葡聚糖[5]，多聚赖氨酸多肽[6]等)，然后将此多聚了的多聚体酶标联到二抗分子上面，既增加了每个二抗分子上标记酶的数目，又使标记酶与二抗有一定的空间距离，减少对二抗特异性和亲和力的不利影响。与前面两种标联方法相比，多聚体酶标联法排除了内源性生物素干扰的可能性，简化了操作步骤(减少了一个步骤，改两步：滴加生物素标记的二抗以及滴加酶标记的生物素成为一步：滴加多聚体酶标联的二抗)同时具有较高的检测灵敏度[5，6]。此方法已成为市场上最为通用的切片标本处理的信号放大方法。但是此方法所存在的缺点是：链式多聚体酶标联的二抗整体结构松散，体积较长，影响了对组织的穿透性，对一些存在于细胞核内特征物质的检测需要比较长的孵育时间以达到所需要的灵敏度，对于一些在福玛琳中固定(浸泡)时间较长的组织的信号放大效果不够有效。