[发明专利]一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学工程中的组织工程学领域，尤其涉及一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法。

背景技术

下咽癌是上消化道和上呼吸道最致命的肿瘤之一，临床统计5年生存率在25%～40%，目前临床上采用以手术为主结合放、化疗的综合治疗方法。对于早期患者切除病灶后可以直接关闭咽腔，而对于中晚期患者因切除面积大，常需要依靠组织移植重建来改善咽喉部功能。传统的可移植组织为来自患者自体的游离空肠、结肠、胸大肌皮瓣、前臂皮瓣等，此类移植不仅来源有限、对血管吻合要求高，而且造成了医源性损伤，容易引起术后并发咽漏、感染等问题。

随着组织工程学的兴起，使用人工下咽瓣膜应用于咽喉部功能重建成为可能。人工下咽瓣膜由于可经体外培养、瓣膜大小不受限制等优点，可用于弥补传统修补手术的不足。医用聚氨酯因其良好的力学强度和弹性，以及良好的生物相容性，被认为是一种较好的生物材料，曾被研究用于体内软组织瓣膜的替代物。但是这类人工瓣膜在使用后发现其降解速度太慢，或者几乎不降解，移植到患者的咽喉部后，随着新生组织的再生此人工瓣膜不能同步降解，反而成为异物存在于下咽部，阻碍新生瓣膜生长的同时，还会产生免疫排斥、炎症等不良反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种力学性能好、降解速度适中、符合人体机能需求的组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种组织工程化的人工下咽瓣膜的制备方法，包括以下具体步骤：

（1）、将己二胺溶于正丙醇中得到浓度为0.01～0.10g/ml的己二胺/正丙醇溶液，将丝素蛋白溶于水中得到浓度为1～10g/L的丝素蛋白水溶液，备用；

（2）、取5～10g聚乙二醇、4.5～10gε-己内酯，以及占两者总质量0.1～1.0%的乙酰丙酮铁，置于干燥的三口烧瓶中，在干燥的氮气保护下，在120～140℃的温度下反应18～40h，得到聚己内酯—聚乙二醇—聚己内酯三嵌段共聚物，即预聚物；

（3）、在反应瓶中将4～10g上述预聚物溶于43～105g的1，4-二氧六环中，在干燥氮气的保护下，在上述反应瓶中加入0.9～2.8g的六亚甲基二异氰酸酯形成溶液体系，向此溶液体系中加入占预聚物质量0.1～1.0%的乙酰丙酮铁，升温至70℃，反应1～3h后停止加热，待体系的温度降至室温，再往此体系中加入含0.13～0.34g三羟甲基丙烷的5毫升1，4-二氧六环溶液，反应5～10h，移出反应瓶，在室温下成膜，得到可生物降解的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；

（4）、取上述平面膜，用体积分数为75%的医用酒精浸洗15～30min，室温晾干，然后将此平面膜浸入步骤（1）准备好的己二胺/正丙醇溶液中，在35℃的温度下浸泡1～2min，取出后用去离子水浸洗3次，每次5～10min，再将平面膜在质量浓度为0.5～2%的戊二醛水溶液中浸泡3～6h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5～10min，最后将平面膜浸入步骤（1）准备好的丝素蛋白水溶液中，在4℃的温度下反应12～24h，取出后用去离子水浸洗3次，每次5～10min，37℃下真空烘干，得到表面接枝丝素蛋白的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜；

（5）、取离体的下咽组织，用含有青霉素和链霉素的无菌PBS混合液冲洗，其中青霉素在PBS混合液中的浓度为1000U/mL，链霉素在PBS混合液中的浓度为1mg/mL，然后将下咽组织在体积分数为75%的医用酒精中浸洗5～10s，取出后用上述PBS混合液冲洗，再将下咽组织浸在1000ppm的次氯酸钠中1～2min，取出后用上述PBS混合液冲洗，然后将下咽组织切成1～3mm³的组织小块贴附于培养皿中，放置30min后，往培养皿中加入含有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基并淹没下咽组织小块，其中：胎牛血清在DMEM培养基中的体积分数为10%、青霉素的浓度为100U/mL、链霉素的浓度为100mg/L，1天后更换上述DMEM培养基，之后每隔2天更换DMEM培养基，约一周后在下咽组织小块的周围长出下咽成纤维细胞，待下咽成纤维细胞长至40～60%时弃去下咽组织块，继续培养下咽成纤维细胞至80%，传代，取传至3～5代的原代下咽成纤维细胞种植于步骤（4）所制得的丝素蛋白接枝的交联型聚己内酯—聚乙二醇—聚六亚甲氨基甲酸酯平面膜上，悬液浓度为5×10⁴/毫升，得到组织工程化的人工下咽瓣膜。