[发明专利]一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、抗原制备方法。

背景技术

结晶紫和孔雀石绿均为有毒的三苯甲烷类化学物，是杀菌和杀寄生虫的化学制剂，可致癌。目前结晶紫和孔雀石绿的残留检测主要方法是采用气相色谱(GC)，气相质谱(GCMS)，液相色谱(HPLC)或液相质谱(LCMS)，以上方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场检测。免疫分析检测技术是近年来在环境及食品检测等领域开发出来的一种新型快速准确检测方法，现已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，也为结晶紫和孔雀石绿的检测提供了新的途径。

结晶紫和孔雀石绿分子本身没有可与载体蛋白结合的可供活化的功能基团，因此无法直接制备人工抗原，需先通过化学方法设计出其半抗原，再进一步与载体蛋白结合获得具有免疫性的完全抗原。由此产生了酶联免疫法这一检测手段。

在中国发明专利申请公布号为“CN103288661A”，公布日为2013年9月11日，名为《一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用》的文件中，公开了一种孔雀石绿半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时公开了所述孔雀石绿半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法和应用。此专利在制备半抗原化合物的过程中需要引入琥珀酸酐，合成的半抗原为酯类结构，此结构稳定性较差，容易发生水解，使抗原失活，不利于保存，无法满足生产需求；

在专利公告号为“CN101451999A”的专利文件中，半抗原的合成需用到醋酐，三氯化铝和溴素，其中醋酐为易制毒化学品，不易购得，而三氯化铝和溴素均为高活性化学品，环境污染严重，且对人体伤害较大。

在专利公告号为“CN101948531A”的专利文件中，以副品红为半抗原，但此结构存在三个氨基，在与蛋白偶联时会出现一个半抗原分子偶联一个，两个或三个蛋白分子的可能，同时也会出现蛋白分子上一个，两个或三个活性基团偶联一个半抗原分子的可能，使得合成的全抗原批间差较大，无法满足生产要求。

在专利公告号为“CN104569372A”的专利文件中，合成的半抗原需用到醋酸钯，此催化剂不仅价格昂贵，而且反应需要在无水无氧的条件下进行，催化剂在储存和反应过程中均易失活，在生产中存在极大风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用，以解决现有技术中制备的原料存在安全隐患，半抗原稳定性差，抗原批间差较大、成本造价高的问题，同时保证对孔雀石绿、结晶紫的高交叉反应率。

为达到上述目的，本发明提供技术如下：

一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原，所述可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原的结构通式如下：

其中n的取值范围为1-5中任意一个整数。

一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原的制作方法，包括如下步骤：

(a)：将4-甲胺基苯甲醛与通式(Ⅰ)所示化合物在无水乙醇和缚酸剂的条件下进行取代反应获得通式(Ⅱ)所示化合物，

通式(Ⅰ)为：

通式(Ⅱ)为：

(b)：将通式(Ⅱ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加入N，N—二甲基苯胺和氯化锌，进行缩合反应，获得通式(Ⅲ)所示化合物，

通式(Ⅲ)为：

(c)：将通式(Ⅲ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加强碱溶液至PH值为10-11，反应获得通式(Ⅳ)所示的半抗原，

通式(Ⅳ)为：

其中，通式(I)中n的取值范围为1-5中任意一个整数，通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)中的n取值与通式(Ⅰ)一致，通式(I)中R为Cl，Br或I中的任意一种。

一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿半抗原的制作方法，按下面比例和步骤制作：

(a)把4-甲胺基苯甲醛和通式(Ⅰ)所示化合物以摩尔比为1：1～1.5的量溶于无水乙醇中，加入K₂CO₃，K₂CO₃与4-甲胺基苯甲醛的摩尔比为0.5～1：1，然后80～90℃回流2～5h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，再用乙酸乙酯萃取，减压去溶剂，石油醚结晶，得到通式(Ⅱ)所示化合物，