[发明专利]一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基。

背景技术

国槐(Sophora japonica Linn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属。国槐为落叶乔木，树势优美，花期较长，极耐修剪，耐寒、耐旱、耐空气污染，又是吉祥、幸福、美好的象征，是理想的行道树种和庭院绿化树种，而且国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药，种子可榨油制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。目前，国槐是嫁接龙爪槐、金枝槐、聊红槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一砧木树种，苗木需求大。国槐主要以种子繁殖为主，但其开花结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干瘪、空洞现象严重。常规的育种方法，依靠种子或扦插繁殖，难以满足生产的需求，基于此有必要对国槐进行组培快繁研究，提供优质、大量国槐种苗，切实解决国槐苗木需求的瓶颈。

国槐古树资源历经千百年的风霜岁月，具有最原始的长寿和抗逆基因，但由于各种原因，衰老死亡的现象时常发生。就古槐衰败的现状来看，常表现为树干腐朽空洞、冠形残缺、顶梢枯萎、枝叶凋零、病虫害严重、根系生长不良等等。这些古槐是大自然和前人留给我们的宝贵的基因资源。

近年来，利用生物转基因技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐育种的新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房的培养均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐的子叶和下胚轴产生了不定芽，王喆之等利用花药培养形成了单倍体植株，Han K.H等(1993，1997)将直径为0.5～1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导愈伤，再将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导生根。上述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直接影响了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁育的目的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导技术研究的较少，可以参考的现有技术比较少。国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因型的限制，其他物种的体细胞胚诱导的繁殖技术对国槐没有参考价值。在这一方面，即使是同一物种，不同的品种之间，体胚诱导培养基也不相同。例如，同样是国槐，同一种培养基，对黄金槐适合，对金叶槐就不适合。

专利CN 102499086 A公开了一种刺槐的繁殖方法，以不同胚龄的合子胚为外植体，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+琼脂为胚性愈伤组织的诱导培养基；以MS基本培养基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-苄氨基腺嘌呤+蔗糖+琼脂为体细胞胚诱导培养基，通过对愈伤组织的诱导，形成球形胚后将其转接到MS+水解酪蛋白培养基上，进行体细胞胚的成熟培养，然后转接到MS基本培养基上萌发形成完整小植株。该专利使用刺槐的不同胚龄的合子胚(荚果)作为原料进行体细胞培养，不论是刺槐还是国槐，其每年的花期以及果实期都是固定的两个月左右，所以在进行体细胞培养时具有时间的局限性；国槐的离体叶片、不成熟的合子胚均可诱导产生胚状体。但是，在山东地区，最近几年的国槐小峰危害非常严重，很难采到无虫害的完整种子。其次，相对于国槐叶片诱导来说，不成熟合子胚的诱导时间更长，且诱导出的丛生芽也不如叶片诱导的多。因此，本专利采用取材方便、诱导率高的叶片进行国槐体胚诱导。国槐与刺槐分属不同的属，物种差别较大，不能参考荚果的体细胞培养得到叶片的体细胞培养。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基，包括芽启动培养基、试管苗增殖培养基、体细胞胚诱导培养基、不定芽诱导培养基、壮苗培养基和生根培养基，其中：

所述芽启动培养基是指：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述试管苗增殖培养基是指：MS+1.0～2.0mg/LBA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述体细胞胚诱导培养基是指：MS+3.0～5.0mg/L 2,4-D+0.5～1.0mg/L BA+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/L TDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；