[发明专利]孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备方法，所述抗氧化肽为Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly，所述抗氧化肽的制备方法包括以下步骤：

1）孔鳐软骨总蛋白粗提物的制备：称取孔鳐软骨切成小碎块，加入适量蒸馏水，在高速组织捣碎机中匀浆至糊状，将糊状的孔鳐软骨浸于4～6倍体积的1.0mol/L盐酸胍溶液中，于4℃下搅拌抽提36～48h；提取液在4℃下以4000～6000r/min离心15～25min，弃残渣收集上清液；上清液继续在4℃、10000～12000r/min离心15～25min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质；将滤液装入分子截留量为8000的透析袋中，用pH值为7.6Tris-HCl的缓冲液于4℃下透析24～48h，透析袋内溶液即为孔鳐软骨总蛋白粗提物；

2）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备：取孔鳐软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%，在-20℃下静置4～6h后，于4℃、10000～12000r/min高速离心20min，取上清液，加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%，获得孔鳐软骨60%丙酮沉淀蛋白，冻干，即为60%丙酮分级沉淀蛋白；

3）孔鳐软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解：取孔鳐软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3～5mL溶于Tris-HCl缓冲液，按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0～3.0%加入胰蛋白酶，于40℃酶解3～5h，然后于90℃、10min灭酶活，酶解液于4℃、10000～12000r/min离心15～25min，弃残渣收集上清液，得软骨蛋白酶解液；

4）孔鳐软骨蛋白抗氧化肽的制备：将上述酶解液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化肽；

其中，所述步骤1）中的盐酸胍溶液含0.02mol/LMES、0.02mol/LEDTA，pH值为7～8；步骤3）中的Tris-HCl缓冲液为0.05mol/L，pH值为7.5～8.5；胰蛋白酶为1.9×104U/g；

步骤4）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：离子交换树脂层析：将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/LNaCl溶液进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；

凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为45～55mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.6～0.8mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的DPPH自由基和羟基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；

反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，收集DPPH自由基和羟自由基清除活性最高的抗氧化肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Gly，ESI-MS测定分子量为700.71Da。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的孔鳐为孔鳐即Rajaporosa。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反相高效液相色谱条件为：进样量10～15μL；色谱柱规格为250mm×4.6mm，填料直径为5μm的ZorbaxSB-C18；流动相为水-乙腈梯度洗脱，0～32min乙腈浓度，由0匀速升至50%；洗脱速度0.6~1.0mL/min；紫外检测波长280nm。