[发明专利]一种理性设计的酶用于再生ATP的方法

说明书

本发明涉及一种理性设计的酶用于再生ATP的方法。通过序列对比后的理性设计，突变并异源表达出了苜蓿中华根瘤菌来源的多聚磷酸激酶并在其催化下，实现以低聚合度的多聚磷酸盐为磷酸供体再生ATP。与现有的ATP再生的方法相比，本发明中应用的多聚磷酸激酶为常温酶，能与多种酶促反应耦合，该酶能以四聚磷酸盐为磷酸供体，与高聚合度聚磷酸相比，四聚磷酸更常见易得，在简化ATP再生过程的基础上增加了ATP再生的可行性，也降低了ATP再生的成本。PPK酶的活性不受聚磷酸盐浓度的抑制，为工业大规模生产提供了可能性。

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种理性设计的酶用于再生ATP的方法。

背景技术

ATP是生物体内最重要的高能磷酸化合物，在医学上被广泛用作肌肉萎缩、心肌梗塞、肝炎和各种急救病症中的治疗或重要辅助治疗药物。工业上也有许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成过程，也都是需要ATP参加的酶促反应。所以，ATP的生产以及工业上ATP的循环再生成为酶工程发展的一个重要问题，是决定工业生产是否经济节约的关键因素。

近年来，对ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸为底物，由多聚磷酸激酶催化产生ATP。对于不同来源的多聚磷酸激酶，催化特点各不相同。如Thermotoga maritima来源的多聚磷酸激酶TePpk是一种嗜热酶，它的最适温度为70度，适合参与温度较高的反应，但在多数常温酶的最适温度(30～37度)条件下酶活较低，不能与常温酶的耦合反应，因此不能广泛的满足工业生产需求。还有一些多聚磷酸激酶，虽然最适温度在30度左右，但是利用的多聚磷酸盐聚合度较高，这种聚合度高的聚磷酸盐在当前在市场上不易得到而且价格昂，这就提高了生产难度和生产成本。另一方面，就工业大量生产ATP而言，一些多聚磷酸激酶会受到多聚磷酸盐的抑制，所以大规模生产时不得不采用流加多聚磷酸盐的方法来减少抑制，使生产过程变得繁琐。所以现在亟需找到一种合适的多聚磷酸激酶，使它既能与许多常温酶耦合参与工业生产，又能够使用比较常见且价格低廉的多聚磷酸盐为磷酸供体，使ATP再生过程方便、廉价、高效。

与公知技术相比，本发明具有以下优点：

1)反应最适温度为30～37度，符合工业生产上多数常温酶的温度要求，应用范围广泛。

2)磷酸供体为低聚合度的多聚磷酸盐，相比聚合度为65或者更高聚合度的多聚磷酸盐，这些低聚合度的多磷酸盐价格低廉且常见易得，使ATP再生过程经济、方便。

3)没有聚磷酸盐抑制现象，能在较高浓度的多聚磷酸底物作用下高效生产ATP。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于蛋白理性设计人工构建的聚磷酸激酶，以低聚合度的多聚磷酸盐为磷酸供体，在聚磷酸激酶的催化条件下生成ATP，为多种消耗ATP的酶促反应源源不断的提供能量。

本发明首先基于一种来自苜蓿中华根瘤菌的多聚磷酸激酶和来自谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶的基因序列比对结果，通过基因突变手段理性改造并异源表达了改造后的来自苜蓿中华根瘤菌的聚磷酸激酶。构建基因工程菌即将改造后的基因ppk(ket)克隆至原核表达载体pET22b中得到多聚磷酸激酶基因表达载体pET22b-ppk(ket)。然后将表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，即可在胞内获得多聚磷酸激酶。

蛋白表达后，通过超声破碎将大肠杆菌中的多聚磷酸激酶释放出来，获得粗酶液。在四聚磷酸或其钠盐为磷酸供体的条件下，以ADP为底物粗酶液催化产生ATP。

本发明提供的方法，以ADP为底物，利用价格低廉的四聚磷酸为磷酸供体，理性设计并异源表达多聚磷酸激酶催化产生ATP，为经济高效生产ATP并在此基础上降低多种酶促反应的成本提供了一种创造性的方法。

图1：DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为多聚磷酸激酶基因ppk(ket)的PCR产物，右侧为DNA大小标准品。