[发明专利]一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物

说明书

本发明涉及一种诱导海洋微生物发酵产κ‑卡拉胶酶的组合诱导物，属于微生物发酵技术领域。所述组合诱导物组成成分按重量份计为0.5~1.5份低聚果糖、1~3份κ‑卡拉胶、0.5~1.5份酵母提取物。以一定配比的低聚果糖、κ‑卡拉胶、酵母提取物作为海洋微生物的产酶诱导物，发酵生产κ‑卡拉胶酶。通过摇瓶振荡发酵48 h，海旋菌（Thalassospirasp.Fjfst‑332）的κ‑卡拉胶酶活力为351 U/mL，与不添加诱导物时，菌株κ‑卡拉胶酶的酶活54.3 U/mL相比，提高了6.46倍。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物。

背景技术

卡拉胶主要存在于角叉菜、麒麟菜及杉藻等海藻的细胞壁中，以α-1,4-D-半乳吡喃糖和β-1,3-D-半乳吡喃糖(或3,6-内醚-D-半乳吡喃糖)交替连接而成的一种亲水性的硫酸酯多糖。根据卡拉胶骨架结构的不同，卡拉胶主要可以分为：κ-型、ι-型和λ-型。

研究显示，卡拉胶及其低聚糖的生物学活性与分子量大小和硫酸根含量密切相关，一般认为，分子量在5000-60000范围具有明显的生物活性，因此经降解后得到的卡拉胶低聚糖有可能成为新型海洋药物的重要来源。目前卡拉胶低聚糖制备方法主要有：物理降解法、化学降解法及酶解法。其中，化学法是制备卡拉胶低聚糖主要方法，但化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等瓶颈问题，制约了其在工业生产中的应用。而酶解法能弥补化学降解法的不足，不但对生产工艺要求简单，反应条件温和、产物活性高，而且产物专一，从而成为制备卡拉胶低聚糖的热点。

已研究发现的卡拉胶酶主要存在于海洋微生物和部分海洋软体动物。其中，大部分已发现卡拉胶酶来自于海洋细菌，包括交替单胞菌属、假单胞菌属、假交替单胞菌属、弧菌属等多种细菌。早在1943年，Mori就成功从海洋软体动物中提取到能够水解角叉菜卡拉胶的酶。研究已经发现并分离纯化出多种卡拉胶酶，其中研究最多的一类为κ-卡拉胶酶。κ-卡拉胶酶能水解κ-卡拉胶的β-1,4糖苷键产生低聚糖，可用于红藻细胞壁结构的分析和原生质体的制备。而海洋微生物产酶量低、酶活性普遍不高，成为了酶解法制备卡拉胶低聚糖的技术瓶颈。因此，寻找合适的诱导物、诱导方法及产酶技术，提高微生物产卡拉胶酶的能力及利用率，成为了国内外的科技工作者的主要方向。

报道显示，不少研究工作者已采用紫外诱导、化学诱导及基因克隆等技术处理卡拉胶酶生产菌株，并有效地提高了其产酶量及酶活，但经过物理、化学及分子生物修饰的菌株产酶稳定性较差，且整个过程耗时耗力，又增加成本，因此仍然没有得到广泛应用。目前国内外研究中，尚没有报道具体的卡拉胶酶诱导物，且没有规模化的卡拉胶酶生产工厂线，因此寻求一种价廉高效的诱导物并应用于卡拉胶酶的生产成为本实验室科研者的研究方向。常见的产酶诱导物如蔗糖、麦芽糖、CMC、果糖等都已经广泛应用于其他蛋白酶的工业化诱导生产。本试验以κ-卡拉胶为专一碳源产酶的基础上，筛选获得一种或几种可有效辅助κ-卡拉胶酶发酵的诱导物或生长因子，以期简化发酵方法及成本，提高κ-卡拉胶酶的产量与活性。

发明内容

本发明的目的是筛选一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物，以期提高菌株产酶能力。

本发明的技术方案：

一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物，所述组合诱导物组成成分按重量份计为0.5~1.5 份低聚果糖、1~3份κ-卡拉胶、0.5~1.5份酵母提取物。

所述低聚果糖：κ-卡拉胶：酵母提取物的最优配比为1：2：1。

所述的海洋微生物为海旋菌、德沃斯氏菌、类芽孢杆菌。

所述的组合诱导物用于海洋微生物产κ-卡拉胶酶的培养方法，包括如下步骤：

1)斜面培养：取微生物菌株接种于斜面培养基中，28 ℃静置培养48 h，获得纯化菌株；