[发明专利]LAG-3亲和肽N13、制备方法及其应用

说明书

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG‑3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8 Da，其序列具体DDFRVWWPNFPR。该肽可采用Fmoc固相多肽合成法制备，同时该肽可作为肿瘤治疗中的药物应用。本申请以真核蛋白rhLAG3‑Fc为靶分子，以hIgG1‑Fc为标签蛋白，通过噬菌体展示肽库高通量技术筛选出了LAG‑3胞外段的亲和肽N13。针对该肽，进一步的体外信号通路阻断试验和小鼠荷瘤试验表明，该肽在肿瘤治疗、延长生物体生存期方面具有较好地应用前景，为生物体肿瘤的免疫治疗提供了新的可能。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG-3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

现有肿瘤治疗技术中，针对肿瘤的免疫治疗被认为是治愈肿瘤的终极手段。已有研究普遍认为：与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。但是由于肿瘤类型的多样性及复杂性，因而肿瘤的免疫治疗既是现有肿瘤研究中的热点，也是研究的难点。

现有肿瘤免疫治疗中，CD8⁺细胞毒T淋巴细胞（CTL）是主要的效应细胞，CD8⁺CTL 需要通过MHC-I类分子介导的细胞免疫应答过程而被激活。肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞（DC）等抗原提呈细胞（APC）加工处理后以MHC/表位复合物的形式提呈至APC的表面，该复合物能被T细胞表面的T细胞受体（TCR）识别，从而形成了激活T细胞的第一信号，即T细胞对抗原的识别；T细胞活化的第二信号来自协同刺激分子，即APC表达的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体或配体相互作用介导的信号。根据产生效应的不同，可将上述共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。在负性共刺激分子中，最重要的是CTLA-4、PD-1及LAG-3等分子。

在肿瘤免疫治疗过程中，肿瘤微环境中负性共刺激分子能引起CTL的功能耗竭和无反应性，而耗竭的CD8⁺CTL无法发挥细胞毒作用以及正常增值和释放细胞因子，最终引起肿瘤免疫耐受和逃逸。而现有针对肿瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，探讨通过联合抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的肿瘤免疫耐受具有更重要的理论意义和应用价值。

淋巴细胞活化基因-3（LAG-3，CD223）作为一个重要的负性共刺激分子，是免疫球蛋白超家族成员的一种膜蛋白，在1990年首次发现报道。成熟的LAG-3分子由470个氨基酸构成，主要通过胞外IgV样结构域与主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）结合。LAG-3通过直接作用于CD8+T细胞而维持自身和肿瘤抗原的免疫耐受性，抗LAG-3单克隆抗体可阻断LAG-3分子的功能，并使肿瘤实质细胞中CD4+T细胞、CD8+T的增殖及功能得以恢复。

针对LAG-3，已有研究认为，LAG-3及其配体MHC-II是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞无能和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，并介导了肿瘤免疫耐受和逃逸，因而理论而言，如果能够获得LAG-3的亲和物质，避免或者减小LAG-3的负性共刺激作用，对于肿瘤的免疫治疗是有十分重要的意义的。

发明内容

本发明主要目的是提供一种LAG-3亲和肽物质N13，同时提供了该亲和肽的制备方法，将该亲和肽进行相应动物实验后，证明了其可以用于肿瘤的免疫治疗。

本发明所采取的详细技术方案介绍如下。

一种LAG-3亲和肽N13，利用噬菌体展示十二肽库液相、固相反向淘选法筛选出来，该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8 Da，其序列如序列表SEQ ID NO.1所示，具体序列为：