[发明专利]炭疽芽孢杆菌荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试 剂盒，属于炭疽芽孢杆菌的体外诊断领域。

背景技术

炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）是有传染性的动物源性细菌，引起动物和人 类炭疽的病原菌，主要感染牛和羊等食草动物，人可以通过接触或食用患病动物及畜产品 而感染。

根据传播途径的不同，人类炭疽可分为三型。第一型为皮肤炭疽（最多见），因接触 患病动物及受染皮毛而感染；病菌从皮肤伤口进入体内并在局部引起炎症，出现水疱、脓 疱，最后形成坏死、溃疡，中心有黑色坏死性焦痂，故名炭疽。第二型肠炭疽，多由食入未煮 熟的病畜肉而感染，以恶心、呕吐、厌食在先，继以发热、腹痛、频繁腹泻及血便，发病后2-3 天可因毒血症而死亡，病死率达25%-60%。第三型肺炭疽，多因处理病畜皮毛时吸入病菌芽 孢，在肺组织局部发芽繁殖，引起呼吸道症状及原发性肺炎，并伴发全身中毒症状。各型炭 疽均能并发败血症，以传染性休克为特征，心肺功能迅速衰竭而致死。败血症型炭疽亦可引 起出血性脑膜炎，患者出现呕吐、惊厥、高热、昏迷和脑膜炎刺激征，脑脊液呈血性或脓性， 继发多器官衰竭，多在第2-4天死亡，病死率100%。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学 检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和 敏感性的基础。

本发明分别针对炭疽芽孢杆菌毒力岛基因序列的保守区域特异的靶序列设计引 物和Taqman探针，利用real-timePCR的方法，用来快速检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌 的核酸。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌，提 供一种特异性检测炭疽芽孢杆菌的荧光PCR试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、 阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和 dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为 含炭疽芽孢杆菌特异性扩增位点的重组质粒。

PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对炭疽芽孢杆菌基因组 群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测 的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对炭疽芽孢杆菌基因组群特异性保守序列设计并经 预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X₁为FAM，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse（见表 1）。

表1检测炭疽芽孢杆菌的引物和探针序列

本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测炭疽芽孢杆菌的应用方法， 包括：

试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μ l、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA2 μl，加灭菌水至终体系20μl。

试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火 50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照 Ct值≤30，否则实验结果不成立。

结果判读：

阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没 有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验， 如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。