[发明专利]用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒

说明书

本发明公开了用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒，其中NM1～NM7的7组引物和探针，每组中突变引物能与NRAS基因保守序列结合，突变ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测NRAS基因7种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对NRAS基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类NRAS基因7种突变的探针、引物及试剂盒。

背景技术

ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。功能上Ras蛋白具有分子开关的作用，正常表达下，能够调控细胞生长。发生点突变，过表达或者基因易位等异常情况会导致细胞异常增殖，并最终引发肿瘤形成，超过30％的人类肿瘤存在Ras的突变。作为ras家族的一员，NRAS在结构和功能上都与KRAS具有很多相似性，并随着近年研究的加深，逐渐成为继KRAS之后另一个为临床病情评估和治疗提供重要依据的分子指标。

在非KRAS基因exon2突变的结直肠癌患者中，NRAS基因突变占7.5％(48/641)。临床研究发现，KRAS或KRAS基因突变的结直肠癌患者不能从帕尼单抗治疗中获益。对临床数据进行多因素风险分析，结果显示NRAS突变是黑色素瘤总体生存率的一个独立不良预后因子。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

发明内容

为了解决现有的NRAS基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。

本发明提供的用于检测人类NRAS基因7种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：

NM1：G12C突变

突变上游ARMS引物NM1-F：SEQ ID NO:1，

突变下游引物NW1-R：SEQ ID NO:3，

检测探针NW1-P：SEQ ID NO:4，

阻断探针NW1-B：SEQ ID NO:5；

NM2：G12D突变

突变上游ARMS引物NM2-F：SEQ ID NO:2，

突变下游引物NW1-R：SEQ ID NO:3，

检测探针NW1-P：SEQ ID NO:4，

阻断探针NW1-B：SEQ ID NO:5；

NM3：Q61K突变

突变上游引物NW2-F：SEQ ID NO:6，

突变下游ARMS引物NM3-R：SEQ ID NO:7，

检测探针NW2-P：SEQ ID NO:12，