[发明专利]一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法

权利要求书

1.一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取马铃薯幼嫩叶片中的总DNA；

2)根据马铃薯质体基因中的trnI-trnA基因序列设计合成了引物C1和C2；

3)以供试马铃薯的总DNA为模板，用高保真DNA聚合酶扩增trnI-trnA基因特异片段，连 入pUC18载体，进行序列测定，得到阳性克隆；

4)设计两对引物GLI1、GLI2和GLA1、GLA2，分别扩增阳性克隆的trnI和trnA区段；

5)将所扩增的trnI区段分别用ClaI和HindIII进行消化，连接入经ClaI和HindIII内 切酶消化的pBio-3载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落，获得pBMLSI-GFP；

6)用MluI和EagI消化所扩增的trnA基因区段，连入经MluI和EagI内切酶消化的 pBMLSI-gfp载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落，培养后提取质粒，完成GFP基因马铃薯 质体表达载体pBMLSIA-GFP的构建。

2.根据权利要求1所述的一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于： 所述的引物C1如SEQIDNO.1所示，引物C2如SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于： 所述的引物GLI1序列如SEQIDNO.3所示，所述的引物GLI2序列如SEQIDNO.4所示，所述 的引物GLA1序列如SEQIDNO.5所示，所述的引物GLA2序列如SEQIDNO.6所示。

4.根据权利要求1所述的一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于： 步骤(4)中PCR扩增体系为：100μLPCR反应体系中加10×PCR反应缓冲液10μL，5’端和3’端 各0.2μmol，5UTaqDNA聚合酶，50ng模板DNA,MgCl₂为2.0mmol/L，各种dNTP为0.2mmol/L。

5.根据权利要求4所述的一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法，其特征在于： 反应条件为：95℃总变性3min，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸180s，共进行30个循 环。