[发明专利]肿瘤相关基因TP53表位多肽单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域:

本发明涉及杂交瘤细胞系及其产生的单克隆抗体与应用，特别是涉及针对TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞系以及该抗体的应用。

技术背景:

TP53是由TP53基因编码的一种细胞周期抑制蛋白质，由393个编码氨基酸组成。TP53蛋白包含多个功能结构域，是TP53基因执行功能的重要结构。TP53基因位于人类染色体17p13.1，全长16kb，分子量为53KD，共有10个内含子和12个外显子，其中第1个外显子不编码。TP53基因是正常细胞增殖和分化的负向调节因子，也是目前研究的最重要的抑癌基因，基因的突变和失调与人类多种肿瘤发生密切相关。TP53基因分为野生型和突变型两种。正常功能的TP53基因又被称为野生型TP53基因，对细胞的生长起负调节作用，参与细胞周期调控，修复DNA损伤，诱发细胞程序性死亡，防止细胞恶性增殖。正常情况下野生型TP53蛋白不稳定，半衰期短，用常规免疫组化方法检测到的TP53蛋白多数为稳定性的突变型TP53表达产物。突变型TP53基因失去调节控制细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力而促进肿瘤生长。

TP53失去正常功能的机理主要表现为两方面，最主要的方式是基因突变，另一个主要方式是TP53与蛋白质相互作用而失活。在大约50％以上的人类肿瘤中，可以发现TP53基因突变导致的功能失调，突变区域主要集中在高度保守区内，使突变体的特异性位点的结合能力和结构域发生改变。在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等肿瘤中，TP53基因缺失率高，功能明显失调。

发明内容:

本发明的目的是提供能与TP53专一结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞系。

本发明提供的单克隆抗体，其是以TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，通过所述免疫原制备获得。

具体地说是使用可以诱发机体产生免疫反应并生成具有中和效应抗体的表位多肽，偶联至KLH作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌得到单克隆抗体。

优选地，上述多肽序列选自：

TP53:PGTRVRQSQHMTELIRVEC

由这个多肽序列与载体蛋白偶联作为免疫原制备获得的单克隆抗体能够特异性地识别该序列，将这个单克隆抗体分别称之为clone 3D1。clone 3D1具有良好的特异性，间接ELISA表明这个抗体具有较高的效价，因此可用于TP53及上述表位多肽的检测。

本发明还提供产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。

本发明提供的单克隆抗体与设计合成表位多肽，可用于检测人血或组织TP53抗体的定量表达，具有高特异性、高敏感性的优点，在临床检测和实验研究中将会得到广泛应用。

附图说明

图1是抗体的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白分子量标准(kDa)，3D1分别为本发明获得的单克隆抗体；

图2是两个克隆的亚型鉴定图，其中clone 3D1显示IgG1信号最强，明中结果判定标准，clone 3D1的亚型为IgG1。

图3所示的是ELISA法灵敏度实验的拟合曲线。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、杂交瘤细胞系的建立

一、实验材料

1、免疫原：本例以TP53基因的高度保守蛋白序列为靶蛋白，设计合成表位多肽，TP53表位多肽：PGTRVRQSQHMTELIRVEC，采用化学合成的方式制备这表位多肽，纯度要求大于95％。表位多肽分别与KLH偶联制备成免疫原。

2、培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公司。

3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。

4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于JacksonImmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。

二、杂交瘤细胞系的建立

1、动物免疫