[发明专利]一种水中肠道病毒分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于水中病毒分离纯化领域；具体涉及一种水中病毒分离纯化的方法。

背景技术

病毒引发的腹泻疾病在发展中国家有显著的致死率，在发达国家也有很高的发病 率，其中儿童患者数量最高。引起急性腹泻的常见病毒包括轮状病毒(RotaViruses)、诺如 病毒(NoroViruses)、星状病毒(AstroViruses)、科萨奇病毒(CoxViruses)和肠道腺病毒 (AdenoViruses)等。由于我国肠道病毒检测研究开展较晚，受限水中病毒分离纯化方法，对 环境及生活水中肠道病毒的检测至今没有国家标准方法。在水中病毒分离纯化技术方面， 现有技术普遍应用超速离心、电势吸附洗脱结合有机絮凝等方对水样本进行快速分离浓 缩，但是由于不同水质中病毒稀薄程度的差异，需要过滤大量水样本，水中病毒分离纯化效 率制约了后期的分子和细胞水平检测方法，另一方面由于超速离心机等设备的过于昂贵， 使得普通检测实验室不具备实验能力，制约了方法的应用。

发明内容

本发明要解决现有病毒浓缩方法中浓缩样病毒回收率低和单位体积病毒含量低 的问题；而提供了一种水中肠道病毒分离纯化方法。

本发明方法能够高效提取水中肠道病毒，并应用荧光定量PCR及细胞水平检测。

本发明包括两种方案：第一种方案是吸附洗脱超滤法，Nanoceram滤膜吸附多聚磷酸盐溶液洗脱结合Plus-70设备进行二次分离纯化方法，该方法应用于大量水样；第二种方案是Plus-70设备一步分离纯化方法，该方法应用于少量水样。

本发明的第一方案——水中肠道病毒分离纯化方法是采用专利号 201410234128.4公开的装置进行的，具体步骤如下：

步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖；

步骤二、然后通入氮气调节存储罐内的压力，打开控制阀，使水样通过过滤器流向 滤膜支架；

步骤三、待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐， 使罐体泄压；

步骤四、更换新的存储罐，向新的存储罐中加入1L质量浓度为1％的多聚磷酸钠溶 液，通入氮气使存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压；

步骤五、打开控制阀，使多聚磷酸钠溶液流向滤膜支架进行洗脱，通过放水管收集 洗脱液，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止洗脱；

步骤六、将滤液杯安装于带有样品杯的Plus-70滤芯上，组装成两套离心杯，然后用去离子水预润洗；

步骤七、取步骤五获得的洗脱液120ml分成两等份，然后分别装入两套离心杯的样 品杯中后盖盖，再将两套离心杯对称放置在离心机内，离心10分钟，取出两套离心杯后将两 个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；

步骤八、重复步骤七直至步骤五收集的洗脱液全部过滤完毕；

步骤九、将经步骤八处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯分别与收集杯组装成两套收集装置，然后对称置于离心机中，离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基(minimumessentialmedium)稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。

方案一进一步限定：步骤七中在离心力为1900×g条件下离心。步骤九中在离心力 为800×g条件下离心。步骤四所述多聚磷酸钠溶液是由3.8mmol/LNa₂HPO₄、6.5mmol/L KH₂PO₄、0.05mol/L氨基乙酸(glycine)和去离子水配制的。