[发明专利]一种检测MMP-9功能的FRET生物传感器及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种检测MMP-9功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述FRET生物传感器含有配体 MMP-9特异底物的蛋白与荧光供体和荧光受体蛋白构建的融合蛋白的真核表达载体。

2.根据权利要求1所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述FRET生 物传感器还含有pcDNA3.1(+)阳性质粒基因序列。

3.根据权利要求1或2所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述配体 MMP-9特异底物的蛋白SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1或2所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器，其特征在于，编码所述 配体MMP-9特异底物的蛋白的碱基序列如SEQIDNO：2所示。

5.根据权利要求1～4之一所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器，其特征在于，所述 荧光供体蛋白为ECFP；荧光受体蛋白为EYFP。

6.一种如权利要求1～5之一所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器的构建方法，其 特征在于，包括以下步骤：

(1)荧光供体蛋白和荧光受体蛋白的基因克隆、鉴定：根据荧光供、受体蛋白质粒的相 应地基因序列设计两对引物P1和P2，P3和P4，并在P1的5’端添加HindIII酶切位点，P2的5’ 端添加BamHI酶切位点，P3的5’端添加BamHI酶切位点和所述配体MMP-9特异底物的蛋白 的碱基序列、Linker碱基序列；在P4的5’端添加EcolI酶切位点，以pcDNA3.1(+)质粒为模 板，克隆含有上下游片段的荧光供、受体的基因全长序列；

(2)FRET生物传感器的构建：将pcDNA3.1(+)和荧光供体的PCR产物分别进行HindIII 和BamHI双酶切处理，并将酶切处理后荧光供体的PCR产物插入同样用HindIII和BamHI 双酶切处理的pcDNA3.1(+)载体中，获得中间重组子pcDNA3.1(+)-ECFP；接着用BamHI和 EcoRI双酶切中间重组子pcDNA3.1(+)-ECFP和荧光受体的PCR产物，并将荧光受体的PCR扩 增产物插入中间重组子pcDNA3.1(+)-ECFP，获得重组质粒载体MMP-9生物传感器，并通过 PCR、酶切、测序验证克隆目的片段的准确性。

7.根据权利要求6所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器的构建方法，其特征在于， 步骤(1)中，所述荧光供、受体蛋白质粒选自pECFP-C1、pEYFP-C1；相应地克隆ECFP的引物对 P1和P2，如SEQIDNO：3和如SEQIDNO：4所示；相应地克隆EYFP的引物对P3和P4，如SEQID NO：5和如SEQIDNO：6所示。

8.根据权利要求1～5之一所述的检测MMP-9功能的FRET生物传感器在活细胞中检测 MMP-9功能的应用。