[发明专利]用于检测人类TP53基因5种突变的探针、引物及试剂盒

说明书

本发明公开了用于检测人类TP53基因5种突变的探针、引物及试剂盒，其中TM1～TM5的5组引物和探针，每组中突变引物能与TP53基因保守序列结合，突变ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测TP53基因5种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对TP53基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类TP53基因5种突变的探针、引物及试剂盒。

背景技术

野生型TP53基因是一种抑癌基因，其编码的p53蛋白能修复已损伤细胞或除去严重损伤的细胞以免除这些细胞对机体的危害。TP53基因突变与人类50％的肿瘤有关，目前发现的就有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等，且在不同肿瘤中TP53等位基因突变存在差异。

人类肿瘤中TP53突变主要在高度保守区内，大部分为错义突变，其中以175、245、248、249、273、283等密码子位点突变最高，这可能是特定癌症发生发展的一个主要因素。研究表明，野生型p53基因能够抑制多药耐药蛋白基因转录，突变型TP53基因则可增强多药耐药基因表达，与肿瘤细胞对铂类化疗药的耐药性相关，但不影响紫杉醇类药的敏感性。因此一般认为TP53基因突变检测可用于指导临床肿瘤患者化疗的个体化用药。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

发明内容

为了解决现有的TP53基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类TP53基因5种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。

本发明提供的用于检测人类TP53基因5种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：

TM1：R175H突变

突变上游ARMS引物TM1-F：SEQ ID NO:2，

突变下游引物TW1-R：SEQ ID NO:1，

检测探针TW1-P：SEQ ID NO:3，

阻断探针TW1-B：SEQ ID NO:4；

TM2：R248W突变

突变上游引物TW2-F：SEQ ID NO:5，

突变下游ARMS引物TM2-R：SEQ ID NO:6，

检测探针TW2-P：SEQ ID NO:8，

阻断探针TW2-B：SEQ ID NO:9；

TM3：R248Q突变

突变上游引物TW2-F：SEQ ID NO:5，

突变下游ARMS引物TM3-R：SEQ ID NO:7，

检测探针TW2-P：SEQ ID NO:8，