[发明专利]一种番红花药材DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种番红花药材DNA的提取方法。

背景技术

番红花，或称藏红花、西红花，为鸢尾科的多年生花卉，是一种名贵的中药材。若以重 量衡量，番红花是世界上最昂贵的香料。番红花是西南亚原生种，但由希腊人最先开始人工 栽培。主要分布在欧洲、地中海及中亚等地，明朝时番红花就传入中国，《本草纲目》将它列 入药物之类，中国浙江等地有栽培。番红花的入药部位是干燥柱头，呈深红色丝状，具有活 血化瘀、凉血解毒、散郁开结、美容养颜等功效，是有名的妇科良药。近些年的研究表明其 具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗癌等作用，更是大大提升了对其活性成分、药理药效、系统 发育、遗传进化、繁殖栽培等方面的研究热度。对于这些研究工作，往往需要获得番红花药 材的DNA，而提取其DNA是必不可少的第一步。

在番红花分子生物学的研究中，多数采用新鲜的番红花叶片组织作为实验材料来获取 DNA，对于市售番红花药材，即其入药部位干燥柱头DNA的提取的研究还未见报道。近年 来，番红花药材昂贵而导致的混伪品掺杂较多，通过分子生物学手段鉴定药材真伪则迫切需 要一种快捷的DNA提取方法。

然而，高质量DNA是进行分子生物学研究的重要保证。迄今为止，人们提出了诸多提 取DNA的方法。然而，不同的材料会对提取DNA的方法有特异性的要求，特别是对经加工 处理后的药材更是如此。由于药材市场上出售的番红花干燥柱头，多数经过了日光暴晒、高 温烘干、微波干燥、硫磺熏制等，导致番红花干燥柱头的DNA含量非常低。另外，番红花 柱头作为食品染料，富含多糖、色素、挥发油和蛋白的特点，其高纯度DNA的提取难度较 大。若采用一般方法提取DNA，一旦失败则需要重新购买番红花药材，其成本过高、代价较 大。因此，迫切需要一种能够适用于番红花干燥柱头等市售药材的高效DNA提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种番红花药材DNA的提取方法，采用番红花干燥柱头，该方 法可以快速、有效的提取番红花药材中的DNA，并且提取到的DNA纯度高。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种番红花药材DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)从药材市场购得番红花药材即干燥柱头，取20mg样品置于1.5mL离心管中，加入 液氮充分研磨1-3min；

(2)迅速加入600-800μL预热的4×CTAB与等体积的氯仿和异戊醇(24:1)，旋涡振荡 3min，充分混匀，10000-13000rpm离心5-8min，吸取上清液于另一离心管中；其中4×CTAB 可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(2MNaCl)是可溶的。氯仿异戊醇去蛋 白，糖类。通过离心可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。

(3)加入2倍体积的预冷无水乙醇和0.2倍体积的NaAc，沉淀DNA，10000-13000rpm 离心8min，弃上清液；采用无水乙醇-盐溶液沉淀DNA，高浓度盐的存在使得大量糖存在于 溶液中。

(4)用2.5倍体积的无水乙醇洗涤DNA两到三次；多次洗涤脱盐可以和其它杂质一并 去除。

(5)将样品DNA在超净工作台上吹干后，加入100μLTE缓冲液，将样品保存在-20℃ 冰箱备用；

(6)用琼脂糖和1×TAE溶液制备0.5％琼脂糖凝胶，点样后进行约45min电泳，再在凝 胶成像分析系统下检测。

其中，所述的4×CTAB包含以下组分：质量百分含量为4％的溴化十六烷基三甲基铵、 0.2mol/L的Tris-HCl(pH＝8.0)、2MNaCl、质量百分含量为1％的聚乙烯聚吡咯烷酮、20mM EDTA(pH＝8.0)，用蒸馏水定容至1L，灭菌，且在使用前加入2mLβ-巯基乙醇。

并且，所述的TE缓冲液组分为：10mMTris-HCl，1mMEDTA；pH＝8.0。

本发明的有益效果是：

(1)将传统的CTAB方法进一步改良和优化，将部分实验流程进行合理的整合，大大 的提高了实验效率。对4×CTAB溶液提前预热，加入样品中以提供高温环境促进两者融合， 从而省去了水浴的过程以及操作的时间。

(2)本方法中使用无水乙醇-盐溶液来沉淀DNA，因核酸的钠盐在乙醇中是不溶解的， 利用此性质可以沉淀核酸。高盐条件也使反应体系保持稳定的酸碱度。