[发明专利]一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系及其建立方法和应用

权利要求书

1.一种永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述永生 化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法包括：

原代培养猪口腔黏膜上皮细胞；

提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转 染法，将质粒导入原代培养的仔猪口腔黏膜上皮细胞；

真核表达质粒pCI-neo-hTERT转染细胞24h后给细胞换液，48h后加含500 μg/mLG418的DMEM/F12培养基筛选；

高倍镜下标记阳性克隆，套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆， 转入另外培养板培养；

扩大培养：用含250μg/mLG418的培养基继续筛选培养一个月，得到抗 G418稳转阳性细胞；

筛选1个月后，培养基中不再添加G418，继续培养超过50代次的细胞即 是永生化的细胞系，永生化的细胞呈现典型的铺路石状，与原代细胞形态一致。

2.如权利要求1所述的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在 于，所述原代培养仔猪口腔黏膜上皮细胞具体包括：

将未哺乳的仔猪麻醉后，心脏采血致死。酒精消毒，剪取面颊部位对应的 口腔上皮组织，无菌条件下PBS(含600IU/ml双抗，5μg/mL的两性霉素B) 漂洗数遍，4℃浸泡30min，将口腔上皮组织剪成＜1mm³的糜状，PBS漂洗3 遍，1000r/min离心5min，接种于96孔培养板，静置10min，加入原代培养用 生长液，置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，24h观察有无细菌污染，每 3d换一次液，每日观察细胞形态及生长情况，培养7～12d。

3.如权利要求1所述的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征 在于，所述将pCI-neo-hTERT转染导入原代培养的仔猪口腔黏膜上皮细胞具体 包括：

转染前48h，0.25％胰酶消化原代仔猪口腔黏膜上皮细胞并计数，以每孔 1×10⁴个细胞接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的汇合度；

用无血清Opti-mem培养液分别稀释2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT 质粒至体积为50μL，使质粒浓度达到0.01μg/μL～0.04μg/μL，轻轻混匀，室温 作用5min；

用无血清Opti-mem培养液稀释Lipofectamine3000TransfectionReagent4 μL至体积为50μL，轻轻混匀，室温作用5min；

混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine3000，此时总体积为100μL，轻轻 混匀，室温作用20min；

逐滴将所得混合物加入到不同孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀；同时 设立2孔未转染空白对照；

于37℃、5％的CO₂培养箱中48h后，加入含500μg/mLG418的DMEM/F12 培养基进行筛选。

4.如权利要求1所述的永生化仔猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征 在于，所述真核表达质粒pCI-neo-hTERT转染细胞24h后给细胞换液，48h后加 含500μg/mLG418的DMEM/F12培养基筛选，从筛选第3天开始有细胞死亡， 第14天时，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有少量细胞存活， 将G418浓度降至250μg/mL维持筛选，每日观察，5d后出现阳性细胞克隆。

5.如权利要求1所述的永生化猪口腔黏膜上皮细胞系的建立方法，其特征在 于，所述阳性克隆的方法有：

套环法：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰酶或EDTA消化，把消化液 吸到另外一个新的培养孔中培养；

刮除法：刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；

无限稀释法：将阳性细胞消化并计数，重新接种于96孔板，每孔1个细胞， 继续培养使其长成单细胞克隆。