[发明专利]一种DBAT突变酶D166H及其应用

说明书

本发明公开一种DBAT突变酶D166H及其应用。所述的突变酶D166H是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了11倍，大大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭Ⅲ的产量。同时，为降低生产成本，本发明寻找了7种新型酰基供体，突变酶均能高效利用乙酸乙烯酯、乙酸戊酯和乙酸异丙烯酯，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高了74倍，能作为替代昂贵的乙酰辅酶A底物用于制备巴卡亭Ⅲ。迄今为止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。

技术领域

本发明属于生物分子催化领域，特别涉及一种DBAT酶(10-去乙酰基巴卡亭III-10β乙酰基转移酶)突变酶D166H及其应用。

背景技术

定制酶一直是生物化学家奋斗的目标。随着分子生物学技术的逐渐成熟，对蛋白序列进行任意修改，可以解读酶的催化机理并继续理性设计酶。这种理性设计可以是增加已有酶的性质，甚至是重新设计一个蛋白质。

高催化活性酶是在生物产业中发挥重要潜能的关键所在，也是现代蛋白质工程研究的主攻方向。新型催化剂的理性设计往往会拓展我们对蛋白生化特性的认识，尤其是那些错误少、时间使用合理的蛋白质理性改造过程。目前已利用理性设计突变位点技术对天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性以及改进酶的别构效应等进行了成功的改造(Kries et al.,2013)。然而，理性设计方法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。

目前理性设计的思路仍然主要是由Hellinga和Richards于1991年提出的给蛋白增加新的结合位点的观点。实际操作中，第一步在蛋白分子内引入新的功能域，第二步再进行优化(Feldmeier et al.,2013；Koga et al.,2012)。

酶活性中心是酶催化的核心部位，其特定的构象不仅有助于底物结合，还能促进高效的催化作用。因此对酶活性位点改造相较整体蛋白质的改造能更为直接，更为显著的提升酶的催化活性(Kiss et al.,2013)。但是，酶的活性中心需要十分精确的构象调节，它既需要一定的柔性去识别底物，完成催化反应，又需要一定的刚性维持合理的构象，来保持良好的生物学活性；酶的活性中心保持着柔性与刚性间的微妙平衡，随意对活性中心的突变，会导致酶的迅速失稳或者失活(Hilvert,2013)。

随着学者们对酶结构与功能关系认知的逐步完善，计算生物学的迅猛发展，利用计算机辅助设计进化酶学性质的方法也日趋成熟。利用计算机模拟的方法，可以快速鉴定与催化直接相关的不可突变的氨基酸和有可能提升酶活性的靶标位点，为蛋白质工程改造提供快速的指导。

本发明通过合成生物学的手段，研究10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶的底物拓展和理性设计新酶，建立合成巴卡亭Ⅲ的新方法。本发明能通过高效制备巴卡亭Ⅲ从而极大的改善紫杉醇供不应求的现状。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的首要在于提供一种DBAT突变酶D166H。该DBAT突变酶D166H比野生型DBAT酶具有更高的催化效率。

本发明的另一目的在于提供上述DBAT突变酶D166H的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种DBAT突变酶D166H，是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由天冬氨酸(Asp)改变为组氨酸(His)。

上述DBAT突变酶D166H的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

本发明另一方面涉及携带具有编码序列为SEQ ID NO：5的DBAT突变酶D166H基因的重组质粒，所述的重组质粒为pET-D166H。