[发明专利]一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其应用，所述蝇蛆抗菌肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；由于所使用的表达系统及所有的表达调控原件都来自于食品级乳酸菌、干酪乳酸菌自身，所以最终表达抗菌肽的重组乳酸菌是真正的食品级产品；抗菌肽展示在乳酸菌细胞壁表面，在宿主肠道内具有较高的稳定性，不容易在肠道环境中降解，便于长期发挥作用；未使用乳酸菌表达常用的诱导型启动子，而使用组成型启动子，发酵时不需要使用Nisin等诱导物，因而其生产工艺十分简便；与从蝇蛆直接提取的抗菌肽相比，表达抗菌肽的重组乳酸菌更加安全，规模化生产成本更低。

(一)技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其应用，特别涉及一种蝇蛆抗菌肽、表达抗菌肽的食品级重组乳酸菌及其制备抗菌添加剂中的应用。

(二)背景技术

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽，它除具有非特异性的抵抗细菌、真菌、病毒等病原体外，还有抗肿瘤细胞的作用，特别对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用，而不破坏人体的正常细胞，是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药。抗菌肽这类活性多肽具有免疫原性小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广等优点。已有研究表明，在动物日粮中添加抗菌肽能够提高动物的生产性能和饲料利用率、改善动物肠道微生态环境、促进动物的细胞和体液免疫应答，提高动物的免疫机能与抗病力。此外，在饲料中添加抗菌肽，可以取代抗生素，消除抗生素的过度使用导致致病菌产生耐药性和农产品抗生素残留的问题。

蝇及幼虫蛆主要生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其体表带有许多病原菌，能传播多种疾病，但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇应该对病原微生物有强大的免疫力，并能产生强效抗菌物质。这种物质就是蝇蛆抗菌肽。

蝇蛆抗菌肽是蝇蛆经过病原菌诱导后而产生的一系列具有抗菌活性的弱酸性多肽物质，热稳定高，其分子量通常在5-10kDa。蝇蛆抗菌肽不仅具有杀灭细菌的功能，还具有抵抗真菌等微生物的功能，甚至病毒、真菌、藻类、原虫及寄生虫，甚至肿瘤等都具有抑制或杀灭作用。

蝇蛆抗菌肽是一系列多种抗菌肽的混合物，单独纯化其中一种抗菌肽极其困难。目前其生产和提取主要依赖天然蝇蛆中提取总抗菌肽，产率低，而且抗菌活性不稳定。同时由于蝇蛆生长环境含有大量病原细菌，因此抗菌肽提取生产过程要严格注意卫生防护，否则产品用于饲料添加用途容易造成病害传播和扩散。蝇蛆抗菌肽距离规模化生产，还有较长的技术差距。

肠道病原菌是家畜和家禽养殖业造成死亡的主要原因之一。养殖业对抗生素的长期使用，造成耐药菌的泛滥。据统计，从猪肠道分离的56株肠道病原菌，85％的菌株对诺氟沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林和头孢噻吩均有耐药性。抗生素过度使用还造成水产品中抗生素残留量过高的严重问题，对消费者的健康造成严重威胁。土霉素，氯霉素等常见水产用抗生素在市售鱼虾蟹类产品中屡有检出，甚至出口产品也屡遭检出。

抗菌肽作为饲料添加剂，可以完全替代抗生素的使用，而且抗菌范围广，无耐药性和抗生素残留的问题。但是抗菌肽的天然来源匮乏和提取成本过高是限制其使用的主要障碍。

采用基因工程技术，利用微生物细胞工厂，导入抗菌肽基因，获得重组表达抗菌肽的工程菌。利用工业化发酵技术，规模化生产重组抗菌肽是可行的技术路线。很多重组药物蛋白使用大肠杆菌，毕赤酵母，芽孢杆菌表达系统已经实现了规模化生产。

乳酸菌是美国FDA认证的可用于食品生产的安全微生物，常见用途之一为饲料添加的益生菌剂，具有改善肠道微生态体系，维持肠道平衡和机能，提高宿主免疫力的功效。乳酸菌是宿主肠道天然共生菌，能够在消化道内黏附和定植，长期发挥益生作用。利用乳酸菌作为宿主，表达重组蝇蛆抗菌肽，抗菌肽分泌或者展示于重组乳酸菌的细胞壁表面。重组活性乳酸菌作为益生菌添加入饲料，饲喂动物。重组乳酸菌在宿主肠道内定殖，不断分泌抗菌肽，杀灭肠道病原菌，促进宿主免疫应答，兼具发挥抗菌和益生菌功效，具有巨大应用潜力。