[发明专利]基于寡脱氧核苷酸链敏化铕离子的荧光探针及其检测三价铁离子的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于寡脱氧核苷酸链敏化稀土铕离子构建的荧光探针及其检测三价铁离 子的用途及方法。

背景技术

作为人体必需的微量元素，铁离子和含铁蛋白发挥着至关重要的作用，涉及血液中氧的 运输，DNA合成，细胞扩散等众多重要的生命过程。铁离子的缺少或过量存在都会导致一些 生理功能的缺失和疾病的发生，例如缺铁性贫血、高血压、不孕不育、中风等。因此对生物 体内中三价铁离子的测定具有非常重要的意义。

目前常规的方法如下表所示：原子吸收光谱法(AAS)；电感耦合等离子体原子发射光谱 法(ICP-AES)；电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)；阴极溶出伏安法(CSV)；流体注射与 化学发光检测法；荧光法等。

传统的三价铁离子的检测方法一般需要昂贵的大型仪器来完成对三价铁离子的检测；而 这个过程需要复杂的前期准备，对样品具有破坏性同时也会造成检测物的损失，在实时原位 高通量快速检测方面存在着局限性。同时，这些方法在快速实时、高灵敏、高选择性检测时 对操作人员提出了很高的要求，检测成本一般较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于寡脱氧核苷酸链敏化稀土铕离子构建荧光探针检测血液 中三价铁离子的用途及方法，以克服现有检测三价铁离子的方法中复杂的前期准备及昂贵的 大型仪器，难以实现原位实时高通量快速检测，不利于大规模推广的缺陷。

本发明首次提出了一种基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针，所述荧光探针为以 胸腺嘧啶寡脱氧核苷酸链oligoT₂₀敏化铕离子形成的荧光探针；所述荧光探针用于检测三价 铁离子。本发明人经过研究4段分别富含20个不同脱氧核苷酸的寡核苷酸链(oligoA₂₀，oligo T₂₀，oligoG₂₀和oligoC₂₀)与稀土铕离子反应，发现只有胸腺嘧啶寡脱氧核苷酸链(oligoT₂₀) 可以有效敏化铕离子使其产生很强的荧光发射。用这个oligoT₂₀敏化的稀土铕离子作为荧光 探针，在缓冲液的环境中荧光可以保持稳定，而当加入三价铁离子后，荧光会发生淬灭，如 图1。基于以上实验发现，本发明提出用oligoT₂₀敏化稀土铕离子将其发展成为一种能够检 测三价铁离子的荧光探针，实现对三价铁离子实时原位的高灵敏度定量检测，并应用于生物 血液中三价铁离子的测定。

本发明还提出了一种基于寡脱氧核苷酸链敏化稀土铕离子构建荧光探针检测三价铁离子 的方法：首先，筛选出有效的配体寡脱氧核苷酸链(oligoT₂₀)来敏化稀土铕离子产生荧光而 制成所述基于寡核苷酸链敏化稀土铕离子的荧光探针；其次，向构建的所述荧光探针中加入 三价铁离子标准溶液或血液样品溶液进行反应发生荧光淬灭；采用时间分辨荧光分析的方法 实现对三价铁离子的检测。

本发明检测方法包括以下步骤：

(1)筛选胸腺嘧啶寡脱氧核苷酸链(oligoT₂₀)用于敏化稀土铕离子构建荧光探针，实 现对三价铁离子的定量检测。所述荧光探针中，oligoT₂₀的终浓度为10μM，稀土铕离子的 终浓度为1mM，所用的缓冲液为Tris-HCl，反应浓度为10mM，所述缓冲液的pH值为7.0～ 9.0；优选地，pH＝7.4。所述反应温度为室温。所述铕离子为1mM三价铕离子。

(2)向获得的oligoT₂₀敏化的稀土铕离子构建荧光探针中加入待测的三价铁离子标准溶 液或血清样品进行反应。所述待测的三价铁离子标准溶液的浓度为0～60μM。所述待测样品 包括血液样品、血清样品等。在具体实施方案中，血清样品为大鼠血清样品。

(3)通过时间分辨荧光分析方法实现对三价铁离子的检测。随着三价铁离子浓度的增加， oligoT₂₀敏化的稀土铕离子构建荧光探针的荧光逐渐降低，即，618nm处的荧光发射峰逐渐 降低，建立工作曲线及标准方程，用荧光值的高低来定量检测三价铁离子的含量。

本发明方法的整个反应体系可控制在微升级别，体积为100μL。优化实验方案可表述如 下：取10μL待测溶液加到90μL荧光探针溶液中，孵育10分钟。通过时间分辨荧光光谱法 进行检测。