[发明专利]单波长实现多光子脉冲STED-SPIM显微系统

说明书

本发明涉及一种单波长实现多光子脉冲STED‑SPIM显微系统，其特征在于，飞秒单波长激光器发出的飞秒脉冲激光经第一偏振态调节器件发送到第一分光器件分成两束光，第一束光沿Y轴方向依次发射到第二偏振态调节器件、第二分光器件、第三偏振态调节器件和四分之一波片成为激发光束；第二束光发送到STED光淬灭系统，经STED光淬灭系统出射的光依次入射到第二分光器件、第三偏振态调节器和四分之一波片调制为面包圈状光焦斑成为淬灭光束；扫描器件用于对激发光束和淬灭光束进行扫描产生激发片光源和STED淬灭片光源，激发片光源和STED淬灭片经激发物镜照射待成像物体使待成像物体的荧光染料激发荧光，激发的荧光经成像物镜成像并依次经滤光片和会聚透镜发射到感光元件或发射到分析元件。

技术领域

本发明是关于一种单波长实现多光子脉冲STED-SPIM显微系统，属于生物分子影像学技术领域。

背景技术

多光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和多光子激发技术的一项新技术。多光子激发的基本原理：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，这两个光子的能量可以加起来，使得荧光分子的电子跃迁至激发态，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相当的。多光子显微镜具有很多优点：1)对样品的光漂白区域小；2)光毒性小；3)穿透力强，多光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍；4)成像亮度和信噪比高。因此，多光子显微镜比单光子显微镜更适合长时间观察和研究活体细胞及组织，更适合对厚的生物样品进行深层次的研究，但是其分辨率和视场有待提高。

SPIM(选择性平面照射显微镜，Selective Plane Illumination Microscopy)以其低成本、样本无需切片、光损伤小、快速扫描成像等特点，现已广泛应用到发育生物学研究和观察细胞的三维结构中。SPIM与其他成像方式相比(传统荧光成像、共聚焦成像等)，SPIM是利用z轴宽场激发方式，CCD和/或CMOS进行信号采集，从而实现更大图像成像的一种宽视场显微技术，该显微镜的工作原理是基于“有选择性的平面成像”技术，激光经过激发物镜在照射物平面内形成一个yz平面的类似椭圆状激发光斑，利用CCD对椭圆状光斑内信号进行收集，从而获得更大范围内的成像，利用TAG对激发光斑在z轴上进行扫描，即可获得更大视场成像，同时辅助检流计对x轴进行扫描，获得三维图像。但是更长的椭圆状激发光斑虽然可以成像的视场更大，但是y轴上更粗，分辨率更差，在SPIM中，视场大小和分辨率是一种竞争关系，互相矛盾。现有的SPIM技术在YZ平面上的光斑宽度较大，极大地影响了YZ的分辨率，传统的解决方法是使用NA(数值孔径)更大的物镜或使用更短的激发波长来缩短光斑宽度，但是同时又造成了YZ平面上光斑长度变短，这意味着成像视场更小。

STED(受激辐射损耗显微镜，Stimulated Emission Depletion Microscopy)利用荧光分子的能级结构和受激辐射选择性消耗PSF(点扩展函数)边沿区域的激发态荧光分子从而压缩PSF尺度，理论上分辨率随着STED光强的增大可以无限提高，首次真正实现了突破衍射极限的远场光学显微镜。调节激光与STED光三维空间重合，其中STED通过相位板和四分之一波片调节为面包圈状光斑，利用荧光分子的能级结构和受激辐射选择性消耗PSF边沿区域的激发态荧光分子从而压缩PSF尺度，最终荧光信号通过两二向色镜到达APD(雪崩光电二极管)，理论上分辨率随着STED光强的增大可以无限提高，然而STED通常是点扫描，因此其成像速度较慢，视场较小，并且STED需要两个激光器进行激发和淬灭，成本较高。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种高时空分辨率的单波长实现STED-SPIM显微系统。