[发明专利]一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体采用Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测金黄色葡萄球菌。

技术背景

金黄色葡萄球菌是最常见的食物中毒病原菌之一，在自然界中随处可见。因此，食品受其污染的机率很大。据美国疾病控制中心报告，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒仅次于大肠杆菌占第二位，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则高达45％。金黄色葡萄球菌是引起临床感染及手术切口感染的主要致病菌之一，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感，但抗生素的广泛应用致使金黄色葡萄球菌耐药菌株的大量出现，使其造成的感染成为与乙型肝炎，艾滋病并列的世界三大感染顽疾。

目前检测金黄色葡萄球菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及生物传感器法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。

胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对金黄色葡萄球菌的检测限通常不高于10⁵CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为金黄色葡萄球菌的检测提供简单、高效的途径。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的金黄色葡萄球菌定性、定量检测技术。

本发明具体方案如下：

一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：

1)纳米微球的制备：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120℃，然后将3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe₃O₄纳米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄纳米粒子用1-10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe₃O₄纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1-10mL去离子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)₃²⁺)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，剧烈搅拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，用去离子水清洗备用；

d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；