[发明专利]冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法

权利要求书

1.冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)复苏冻存脐血细胞，在培养瓶中进行贴壁培养；

(2)DC细胞制备：反复吹打步骤(1)中的培养瓶壁，得到DC贴壁细胞，收取悬浮细胞移入 另一培养瓶中做CIK细胞培养备用，在DC细胞完全培养基加入GM-CSF和IL-4后添加至具有 DC贴壁细胞的培养瓶中进行培养，获得DC细胞；

(3)CIK细胞制备：将收集步骤(2)的悬浮细胞调整密度，加入IFN-Y，培养20～24小时 后，加入IL-2、IL-1a、和CD3MAb，进行细胞培养，获得CIK细胞。

2.根据权利要求1所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (2)中，反复吹打培养瓶壁收取悬浮细胞后，向培养瓶加入GT-T515无血清培养基，再次反复 吹打瓶壁收取悬浮细胞，重复上述操作，直至在显微镜下能够清晰观察DC贴壁细胞。

3.根据权利要求1所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (2)中，DC细胞培养8～14天，细胞培养第一天添加因子IFN-Y至终浓度1000IU/ml。

4.根据权利要求1所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在收取DC 细胞前添加肿瘤抗原至终浓度50ng/ml。

5.根据权利要求3所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (2)中，DC细胞培养第4天进行2/3换液，补液中GM-CSF终浓度为1000IU/ml、IL-4终浓度为 500IU/ml。

6.根据权利要求3所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (2)DC细胞培养过程中，若培养液变橙黄色则按原培养液体积25％补液，补液中GM-CSF终浓 度为1000IU/ml、IL-4终浓度为500IU/ml。

7.根据权利要求1所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (3)中调整悬浮细胞密度最低密度调整为10⁸个/ml。

8.根据权利要求1所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (3)中，CIK细胞培养12～16天，细胞培养第一天添加因子IFN-Y至终浓度1000IU/ml，细胞培 养第二天添加因子IL-2至终浓度为1000IU/ml，IL-1a至终浓度为500IU/ml，CD3MAb至终浓 度为375ng/ml。

9.根据权利要求8所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (3)CIK细胞培养过程中，若培养液变橙黄色则按原培养液体积20％补液，补液中IL-2终浓 度为1000IU/ml，IL-1a终浓度为500IU/ml，CD3MAb终浓度为375ng/ml。

10.根据权利要求8所述的冻存脐血细胞诱导DC-CIK细胞的方法，其特征在于，在步骤 (3)CIK细胞培养第4天和第8天均进行2/3换液，补液中IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-1a终浓 度为500IU/ml，CD3MAb终浓度为375ng/ml。