[发明专利]一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株联产Surfactin和Plipastatin，命名为 pB2-L，在2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号 为CGMCCNo.11723。

2.一种重组质粒pDL-PSQ，其特征在于：该重组质粒序列如SEQIDNO.1所示，包括sfp 基因和degQ基因。

3.权利要求2所述的重组质粒pDL-PSQ，其特征在于：该重组质粒以P43基因为启动子， amyE为同源臂。

4.一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该方 法包括如下步骤：

(1)设计引物对P43-F和P43-R、sfp-F和sfp-R、degQ-F和degQ-R；以B.subtilisfmbJ的 基因组DNA为模板，PCR扩增sfp基因和degQ基因；以B.subtilispB2基因组DNA为模板，PCR 扩增启动子P43基因；

(2)设计引物对PS-F和PS-R，通过重叠延伸PCR扩增，获得融合片段P43-sfp；

(3)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将degQ基因片段插入质粒pDL的酶切位 点之间得到质粒pDL-degQ；

(4)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将融合片段P43-sfp插入质粒pDL- degQ，最后获得重组整合质粒pDL-PSQ；

(5)将重组整合质粒pDL-PSQ转入B.subtilispB2菌株中，通过同源臂位点交换，将目 的基因P43-sfp-degQ整合到了基因组中，抗性筛选，获得阳性转化子，即为联产Surfactin 和Plipastatin的枯草芽孢杆菌工程菌，命名为B.subtilispB2-L。

5.权利要求4所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)通过PCR扩增，在启动子P43基因中 引入EcoRI酶切位点，在sfp基因中引入BamHI酶切位点，在degQ基因中引入BamHI和SacI酶 切位点。

6.权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述引物对序列如下：

P43-F：如SEQIDNO.2所示；P43-R：如SEQIDNO.3所示；

sfp-F：如SEQIDNO.4所示；sfp-R：如SEQIDNO.5所示；

degQ-F：如SEQIDNO.6所示；degQ-R：如SEQIDNO.7所示。

7.权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述引物对序列如下：

PS-F：如SEQIDNO.8所示；PS-R：如SEQIDNO.9所示。

8.根据权利要求4-7任一项所述方法获得的联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢 杆菌。

9.权利要求8所述的枯草芽孢杆菌工程在革兰氏阳性细菌、丝状真菌抑制方面的应用。

10.权利要求8所述的枯草芽孢杆菌工程在桃软腐病菌防治方面的应用。