[发明专利]一种膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物深加工技术领域，特别涉及一种膨胀床与吸附树脂固定床偶 联提取藻蓝蛋白的方法。

背景技术

藻蓝蛋白是水溶性的，破壁提取使得其他蛋白质等也存在于粗提液中，造成粗提 取液中藻蓝蛋白的纯度低，这就导致要增加纯化步骤来提高藻蓝蛋白的纯度。目前，研究者 们尝试了许多简单、高效地提高藻蓝蛋白纯度的分离纯化方法，如多次双水相萃取结合法、 双水相萃取结合离子交换色谱法、膨胀床吸附结合传统的凝胶过滤和离子交换色谱法、活 性炭和甲壳素吸附处理结合离子交换色谱法等。

大孔吸附树脂是一类与离子交换树脂不同的分离材料，能将吸附和筛选性能相结 合，可用于生物大分子的分离纯化中。

螺旋藻藻蓝蛋白存在于螺旋藻的藻胆体中。藻胆体是红藻和蓝藻所特有的一种超 分子捕光色素复合体。藻蓝蛋白色泽呈明亮的蓝色，颜色鲜艳，是食品、高级眼影、唇膏的首 选纯天然色素。藻蓝蛋白还可以调节和合成人体代谢所需要的多种重要酶，具有明显的抗 氧化、抗炎症作用，调节人体免疫系统，增强免疫系统功能。高纯度的藻蓝蛋白带有很强的 荧光，制成的纯天然荧光试剂，用于临床医学诊断，免疫化学及生物医学工程等研究领域。

在我国，每年的螺旋藻全国总产量已达到7000吨。螺旋藻产量的三分之一用于直 接出口，其余螺旋藻多以藻粉、藻片和灌注胶囊的形式当作保健品使用。螺旋藻的规模化开 发和利用处于初级加工阶段，还没有深加工产品。螺旋藻中藻蓝蛋白的提取还处于实验室 研究阶段，没有适合于工业化生产的好的工艺方法。目前，市场上销售的高纯度的藻蓝蛋白 商品都是从国外进口，价格昂贵，在应用上受到限制。

膨胀床吸附是近年出现的一种新型生物分离技术，具有集成化优势，可以直接从 含有颗粒的料液中捕获目标产物，集料液澄清、目标产物浓缩和分离纯化为一体，从而达到 简化操作步骤，提高产品收率，降低生产成本的目的。膨胀床吸附技术现已成功用于各种未 澄清粗提液中直接捕获蛋白质等生物制品的领域，如E.coli匀浆、酵母发酵液、哺乳动物细 胞培养液、牛奶和动物组织提取物等，也有应用在天然产物小分子物质分离领域中。膨胀床 兼有固定床和流化床的优点和集成化的特点，降低了分离纯化的成本，该技术在藻蓝蛋白 分离纯化过程中的应用为实现藻蓝蛋白生产的规模化提供了可能。

目前，缺乏一种纯化效率高的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方 法。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化效率高的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝 蛋白的方法。

为了实现上述技术问题，本发明提供的技术方案为：本发明的一种膨胀床与吸附 树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：

本发明的一种膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,包括以下步 骤：

(1)大孔吸附树脂预处理；

(2)大孔吸附树脂静态吸附去杂蛋白，筛选出目的大孔吸附树脂；

(3)制备藻蓝蛋白粗提液：称取螺旋藻干粉，用反复冻融法进行细胞破壁，提取藻 蓝蛋白；

(4)膨胀床吸附分离藻蓝蛋白；

(5)膨胀床偶联ADS-7固定床吸附纯化藻蓝蛋白，制得纯化的藻蓝蛋白。

进一步地，在步骤(1)中，先用去离子水洗涤至水中无浑浊后，用95％乙醇浸泡 24h，再用去离子水洗至无乙醇味，除去树脂大孔内残留的溶剂及其它杂质，然后用4％盐酸 浸泡2h，用去离子水洗至中性，再用4％氢氧化钠浸泡2h，用去离子水洗至中性，抽滤，室温 晾干至树脂不相互粘连待用。

进一步地，在步骤(2)中，称取大孔吸附树脂0.15g置于50mL具塞三角瓶中，加入 30mL藻蓝蛋白粗提液，密封，在200rpm/min，25℃下恒温振荡吸附3h；

吸附后，取上清液，分别测定280nm、620nm和650nm处的吸光度值，计算吸附后藻蓝 蛋白的纯度和含量，吸附前后总固形物含量和总蛋白含量，计算大孔吸附树脂对总蛋白、藻 蓝蛋白、杂质蛋白及固形物杂质的吸附容量，筛选出目的大孔吸附树脂。

更进一步地，在步骤(3)中，以螺旋藻干粉与磷酸钠盐缓冲液的固液比为1:150g/ mL，在-20℃和37℃反复冻融5次，每次冻融时间为4h；将冻融5次后的破壁液于5000rpm下离 心30min，收集上清液得到藻蓝蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中储藏备用。