[发明专利]一种快速检测沙门氏菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体采用Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测沙门氏菌。

技术背景

随着人民生活水平的不断提高，食品安全问题广泛受到社会各界关注和重视。在全球食品安全中毒事件中，由食源性致病菌引发的中毒事件已经对人类的健康和社会发展造成严重的损失和危害。沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中沙门氏菌引发的中毒病例占第一位。沙门氏菌在自然界中具有广泛的宿主，很容易在动物与动物之间、动物与人之间、人与人之间直接或间接的途径进行传播。人类感染沙门氏菌的主要途径是食入被沙门氏菌污染水以及食品如：鸡蛋、牛奶、肉制品和蔬菜等。人类感染沙门氏菌的主要症状表现为为腹泻、胃肠炎、高烧和败血症等，严重危害人类的健康。

目前检测沙门氏菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及生物传感器法对沙门氏菌的检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。

胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对沙门氏菌的检测限通常不高于10⁵CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为沙门氏菌的检测提供简单、高效的途径。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的沙门氏菌定性、定量检测技术。

本发明具体方案如下：

一种快速检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

1)纳米微球的制备：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120℃，然后将3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe₃O₄纳米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄纳米粒子用1-10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe₃O₄纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1-10mL去离子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)₃²⁺)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，剧烈搅拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，用去离子水清洗备用；

d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；