[发明专利]一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法及应用

权利要求书

1.一种基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶制备方法，其特征在于，步骤为：

1）室温下，将牛血清白蛋白、尿素、EDTA和水混合，搅拌20 min，得浓度分别为7-10 mg/mL牛血清白蛋白、5-8 M尿素和1.8-3.2 mMEDTA的混合液，随后向混合液中加入1,4-二巯基苏糖醇至浓度为0.08-0.2 mM，然后在氮气保护下继续搅拌30min，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白液，备用；

2）室温下，将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、氯化血红素和水混合，得浓度分别为90-120 mM 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、70-100 mM N-羟基琥珀酰亚胺和1.5-3.0 mg/mL 氯化血红素的混合液，20-25℃搅拌活化1h，然后按照混合液与含巯基的链状牛血清白蛋白溶液体积比1：10加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液，在35-40℃下搅拌1-3h，再用去离子水透析10-14h，得含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液；

3）将步骤2）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白-氯化血红素溶液与8-12 mM的四氯金酸水溶液按照体积比10:1混合，搅拌10 min，然后加入1.0 M 的NaOH 水溶液调节混合溶液pH值为10-12，并在37℃下继续搅拌8-10h，再用去离子水透析10-14h，得基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的牛血清白蛋白、尿素、EDTA与1,4-二巯基苏糖醇的浓度依次为8.0 mg/mL，6 M ，2.0 mM，0.10 mM。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与氯化血红素的浓度依次为100 mM，80mM， 2.0 mg/mL；加入步骤1）制备的含巯基的链状牛血清白蛋白溶液后，搅拌温度为37℃，搅拌时间为2h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述的四氯金酸水溶液为10 mM；所述的调节混合溶液pH值为12；所述的37℃下继续搅拌时间为8 h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）、2）、3）中，所述去离子水透析时间为12h；所述室温为20-25℃；所述的溶液如无特别说明，均为水配；所述的透析采用规格为14 KDa的透析袋。

6.根据权利要求 1-5 任一项 制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶的应用，其特征在于：用于食品中H₂O₂含量的速测，测试方法为比色法或电分析法。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的比色法方法为：

1）建立标准曲线：室温条件下, 将上述制备得到的基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为10 μL 2.0 μg/mL的水溶液，然后加入到200μL含0.69 mM TMB的柠檬酸缓冲溶液中，然后分别加浓度梯度范围为0.0030 - 0.21 mM的H₂O₂，静置20 min，在波长652nm下分别测定吸光度值，建立浓度-吸光度标准曲线，得标准曲线方程；

2）待测样品检测：将待测样品预处理得稀释液，将基于血红素和纳米金簇的蛋白模拟酶配制为2.0 μg/mL的水溶液，滴入到稀释液中进行显色反应，在波长652nm下测定吸光度值，然后结合浓度-吸光度标准曲线及标准曲线方程计算所含过氧化物浓度；

步骤1）中所述柠檬酸缓冲溶液，pH 为7.40，浓度为0.1M。