[发明专利]一种提取纯化波形蛋白的方法在审
| 申请号： | 201610038575.1 | 申请日： | 2016-01-20 |
| 公开（公告）号： | CN105693841A | 公开（公告）日： | 2016-06-22 |
| 发明（设计）人： | 方成;陈卓 | 申请（专利权）人： | 武汉轻工大学 |
| 主分类号： | C07K14/47 | 分类号： | C07K14/47;C07K1/18 |
| 代理公司： | 武汉开元知识产权代理有限公司 42104 | 代理人： | 涂洁 |
| 地址： | 430023 湖北省*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 提取 纯化 波形 蛋白 方法 | ||
1.一种波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗提：解剖猪眼取晶状体，浸入粗提液后匀浆制得混悬液； 将混悬液离心后弃上清液，取沉淀物重悬数次并离心；取沉淀物冻干 制得粗提粉；
(2)精提：用精提液溶解步骤(1)中的粗提粉，离心后弃沉淀， 取上清液浓缩后得到精提物溶液；
(3)分离：取精提物溶液上样到预平衡的DEAESepharoseFF 柱，先使用第一缓冲液洗脱大部分的42kDa杂蛋白，再使用第二缓冲 液进行线性洗脱，收集线性洗脱的馏分；
(4)纯化：对收集的馏分用10％SDS-PAGE电泳，做Western-Blot 实验进行蛋白成分鉴定；合并53kDa目标波形蛋白含量达80wt％以上 的馏分，经透析、冻干即得纯化Vim粉。
2.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于， 所述步骤(3)中，所述第一缓冲液中含有36mMNaH2PO4、8M尿素、 0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH 值为7.0。
3.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于， 所述步骤(3)中，所述第二缓冲液中含有36-86mMNaH2PO4、8M尿 素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT， 其pH值为7.0；进行线性洗脱时，第二缓冲液以36mMNaH2PO4为起始 洗脱浓度，以86mMNaH2PO4为终止洗脱浓度。
4.如权利要求1或3所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征 在于，所述步骤(3)中，所述第二缓冲液线性洗脱参数为：流速 1ml/min，压力0.5MPa，NaH2PO4线性上升梯度0.5mM/1ml。
5.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于， 所述步骤(3)中，第一缓冲液的洗脱体积至少为40ml；控制第二缓 冲液的洗脱体积为100ml，2ml一管收集馏分。
6.如权利要求1所述的波形蛋白的提取纯化方法，其特征在于， 所述步骤(2)中，精提液含有10mMNaH2PO4、8M尿素、0.5mMPMSF、 1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0，4 ℃预冷。
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