[发明专利]高保真度限制性内切核酸酶

权利要求书

1.组合物，其包括：具有导致至少2的总保真度指数(FI)改进因子的人工引入突变的限 制性内切核酸酶，其中所述因子是通过凝胶电泳测定的在限定组的缓冲液中，突变体的切 割活性对不具有可检测星号活性的未突变限制性内切核酸酶的切割活性的最佳比率，所述 人工引入突变包括用带相反电荷的丙氨酸或苯丙氨酸置换天然存在的残基，其中所述总保 真度指数(FI)改进因子是指在选择的缓冲液组中具有最大切割活性的突变体的最高FI除 以具有最大切割活性的相应WT内切核酸酶的最高FI，并且保真度指数是指在一种缓冲液中 不具有星号活性的限制性内切核酸酶的最高浓度除以使底物完全消化的最低浓度的比率。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个所述人工引入突变是在所述限制性内 切核酸酶的靶位点处，用带相反电荷的残基置换天然存在的残基。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个所述人工引入突变是在所述限制性内 切核酸酶的靶位点处，用选自苯丙氨酸和丙氨酸的残基置换天然存在的残基。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶选自BamHI、EcoRI、ScaI、SalI、SphI、PstI、NcoI、NheI、SspI、NotI、SacI、PvuII、MfeI、 HindIII、SbfI、EagI、EcoRV、AvrII、BstXI、PciI、HpaI、AgeI、BsmBI、BspQI、SapI、KpnI和 BsaI。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶是BamHI，并且所述人工引入突变选自：E163A/E167T；K30A；E86A；E86P；K87A；K87E； K87V；K87N；P144A；Y165F；E167A；E167R；E167K；E167L；E167I；K30A/E86A；E86A/K106A； K30A/E86A/K106A；K30A/K87A；E86P/K87E；E86A/Y165F；K30A/E167A；E163S/E170T/P173A； E163S/E170T/P173A；E86P/K87T/K88N/E163S/E170T/P173A；E86P/K87R/K88G/E163S/ E170T/P173A；E86P/K87P/K88R/E163S/E170T/P173A/E211K；E86P/K87T/K88R/E163S/ E170T/P173A/N158S；E86P/K87S/K88P/E163S/E170T/P173A；E86P/K87G/K88S/E163S/ E170T/P173A；E86P/K87R/K88Q/E163S/E170T/P173A；和E86P/K87W/K88V；和E86P/P173A。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶是EcoRI，并且所述人工引入突变选自：K62A；K62S；K62L；R9A；K15A；R123A；K130A； R131A；R183A；S2Y；D135A；R187A；和K62E。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶是ScaI，并且所述人工引入突变选自R18A；R112A；E119A；H193A；S201F；和H193A/ S201F。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶是SalI，并且所述人工引入突变选自R82A；K93A；K101A；和R107A。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶是SphI，并且所述人工引入突变选自D91A；D139A；D164A；和K100A。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核 酸酶是PstI，并且所述人工引入突变选自E204G；K228A；K228A/A289V；和D91A。