[发明专利]一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敲除突变体菌株的构建方法

说明书

一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单敲除突变体菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)利用split‑PCR方法，将禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成过程中的负调控因子高亲和性磷酸二酯酶基因FgPDE2从禾谷镰刀菌PH‑1的基因组中敲除，获得单敲除突变体；FgPDE2的基因及上下游序列如SEQ ID NO：1所示；(2)采用PEG‑介导的原生质体转化到禾谷镰刀菌中，然后采用抗性筛选标记筛选敲除转化子；最后以禾谷镰刀菌的基因组为参照，利用5F和6R引物验证敲除转化子的目的基因被新霉素抗性基因所替代。本发明单敲除突变体菌株产毒量大幅提高；而双敲除突变体菌株产毒量更高，且该基因改造突变体丧失了对小麦穗的侵染能力，大大降低了双敲除突变体菌株可能的扩散造成的不良后果。

技术领域

本发明一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敲除突变体菌株的构建方法，具体涉及一种高产禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敲除突变体菌株的构建方法。

背景技术

禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病(Fusarium head blight or scab)的病原真菌，不仅严重影响作物产量，而且可以产生多种对人畜有害的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，使粮食或饲料的品质降低。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是一种倍半萜烯化合物，不易降解、稳定性高，在自然界中广泛存在，被认为是主要由镰刀菌在缺乏营养物质时，合成并作为主要天然毒素存在于赤霉病发病小麦中。DON毒素是污染率最高的真菌毒素之一，主要污染小麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等；另外，在动物的奶、蛋中也有DON残留的报道。该毒素可抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，可随食品、饲料进入食物链，严重威胁人畜健康。

我国是世界上受DON危害最严重的国家之一。因此，对谷物类制品中DON毒素的筛查及危害评估势在必行，对DON毒素形成机理的研究也同样需要大规模、大范围的开展起来。事实上，我国检验检疫部门一直十分重视这种毒素的检测监控研究，相关的科学研究也一直是赤霉病科研工作者的工作重点。然而，这些工作由于需要用到大量的DON毒素标准品，这些毒素标准品的价格又非常昂贵(1mg价格约为1000元人民币)，而且多是从国外出口，由此这些因素严重限制了相关工作的开展。由于真菌毒素涉及食品安全、环保、医疗等领域，需求广泛。因此，相关标准物制备已成为世界上各国研究的热点。

我国在真菌毒素标准物质制备方面的工作起步较晚，当前，合成真菌毒素标准品主要利用化学合成的方法，通过菌株培养、发酵、提取、纯化等制备工艺获得，虽然经历了不断的优化和工艺的完善，提取效率相对上世纪已有明显提高，但是真菌毒素得率仍相当有限，且纯化成本高昂。因此，真菌毒素提取制备工艺流程优化空间越来越小，研究人员已开始从筛选高产毒菌株入手寻求突破。菌株作为毒素制备的核心材料，其产毒能力决定了制备物质的生产效率、纯度和制备成本。目前，禾谷镰刀菌是DON主要的产毒菌种，我国研究人员主要通过对不同产地，不同来源的产毒真菌进行分离及毒素的测定，进而筛选适合工业生产的产毒菌株。然而，自然界中获取的禾谷镰刀菌产毒能力差别不大，很难筛选出高产毒量的菌株应用于规模生产。

现今，基因改造技术日益发展，而且在很多物种中已经有了基因改造获得良种的尝试。因此，开发一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单敲除突变体菌株的构建方法，可大规模应用于工业生产，已经是菌种资源研究的当务之急。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的单敲除突变体菌株的构建方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种高产脱氧雪腐镰刀菌烯醇的敲除突变体菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)构建基因敲除载体：利用split-PCR方法，将禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成过程中的负调控因子高亲和性磷酸二酯酶基因FgPDE2从禾谷镰刀菌PH-1的基因组中敲除，获得单敲除突变体；FgPDE2的基因及上下游序列如SEQ ID NO：1所示；