[发明专利]一种人脐带间质干细胞分离并诱导为软骨细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及间充质肝细胞技术领域，具体地，为一种人脐带分离培养间质干细胞 并诱导为软骨细胞的培养方法。

背景技术

关节软骨损伤在临床上较为常见，由于关节软骨无血液供应和神经支配，自身修 复能力很差，关节软骨一旦损伤即很难修复，如不及时治疗，继而会发生不可逆的病理变 化，造成关节的退行性改变(关节炎)，严重影响患者的生活质量，临床症状主要表现为关节 活动后肿胀、疼痛，上下楼、下蹲困难。

间质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，间质干细胞存在于人体多种组织 中，尤其是脐带、胎盘、骨髓、脂肪组织，这种干细胞在不同的诱导条件下可分化成许多不同 的组织，如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织等，2002 年Wakitani等首次报道间质干细胞可定向到软骨细胞用于治疗软骨损伤。

发明内容

本发明采用人脐带间质干细胞(hUC-MSCs)其目的在于提供一种生长速度快、方法 简单，费用低，生物安全性高的软骨细胞培养方法。本发明是采用如下方案实现的：

一种人脐带间质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤，

(1)原代培养：取预处理过的人脐带沃顿胶组织，进行原代培养，原代培养采用 MesenGro培养液培养，MesenGro培养液包括MesenGro培养基、胎牛血清、青霉素和/或链霉 素双抗、阿卡米星、成纤维细胞生长因子，带细胞游出后，用胰蛋白酶消化离心，得到原代人 脐带间质干细胞；

(2)传代培养：对得到的原代细胞置于新的MesenGro培养液进行传代培养，待细胞 长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化离心，得到第二代细胞；并使用同样方法得到重复 进行第二代到第三代传代人脐带间质干细胞的培养。

优选地，步骤(1)中，所采用的胎牛血清的浓度为5％～20％，青霉素/链霉素双抗 的浓度为80～120U/mL，阿卡米星的浓度为5～10mg/L，成纤维细胞生长因子的浓度为8～13 μg/L。

优选地，步骤(1)中，培养温度为37℃，环境空气为5％CO₂。

优选地，步骤(2)中，培养温度为37℃，环境空气为5％CO₂。

一种人脐带间质干细胞分化诱导为软骨细胞的培养方法，取上述第三代传代脐带 间质干细胞，与人关节软骨细胞(hACs)共培养，诱导分化为软骨细胞。

优选地，所述人关节软骨细胞(hACs)的获取方法为，取膝关节非负重区软骨，使用 Ⅱ型胶原酶消化后过滤，弃上清液，收集软骨细胞，接种于培养瓶内，使用含10％胎牛血清 的DMEM/F12培养基培养。待细胞达到80％～90％融合时，消化传代成第1代细胞，然后再对 第一代细胞置37℃、5％CO₂的培养箱中继续培养，获得第2代人关节软骨细胞(hACs)。

优选地，软骨细胞的培养方法为，将第三代传代人脐带间质干细胞与第二代人关 节软骨细胞(hACs)，按1：1的比例接种于DMEM/F12培养液中，进行共培养。

脐带间质干细胞和软骨细胞共培养，两种细胞相互促进增殖和分化，可减少软骨 细胞增殖传代次数并节省软骨细胞数量，方法简单，费用低，生物安全性高，对建立种子细 胞源是一种实用的策略，也为优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源提供了实验依据。

附图说明

图1A实施例1利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD34和 CD45的检测结果

图1B实施例1利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD105和 CD73的检测结果

图2A实施例2利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD34和 CD45的检测结果

图2B实施例2利用流式细胞仪对第三代传代人脐带间质干细胞表面抗原CD105和 CD73的检测结果

图3A实施例1利用RT-qPCR技术对SOX9基因的转录情况表征

图3B实施例1利用RT-qPCR技术对I型胶原基因的转录情况表征

图3C实施例1利用RT-qPCR技术对Ⅱ型胶原基因的转录情况表征

具体实施方式