[发明专利]基于NBDK的定点荧光标记方法

权利要求书

1.一种基于NBDK的定点荧光标记方法，其特征在于，所述基于NBDK的定点荧光标记方法包括如下步骤：

S1：获得产甲烷厌氧菌的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(M.Barkeri PylRS)突变库；

S2：获得7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-赖氨酸(NBDK)；

S3：筛选特异识别NBDK的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体(NBDKRS)，所述步骤S3包括：步骤S31，构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒；步骤S32，构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒，进行转化和筛选后获得用于特异识别NBDK的NBDKRS的菌株，所述pylT基因编码NBDK氨酰-tRNA合成酶；

S4：在鲸鱼肌红蛋白的4种密码子标签(Myoglobin-4TAG)中插入NBDK，验证筛选得到的NBDKRS能够实现目的蛋白的红色荧光标记；

所述步骤S1包括如下步骤：

S11：人工合成M.Barkeri PylRS的DNA序列；

S12：将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒A；

S13：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L260NNK和引物r-L260NNK、引物f-L270NNK和引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK、引物f-W382NNk和引物r-W382NNk，所述引物f-L260NNK的序列为aacNNKtgcctgcgtccgatgctggc，所述引物r-L260NNK的序列为ggcaMNNgtttttatccacgcgga，所述引物f-L270NNK的序列为accNNKtataactatctgcgtaaac，所述引物r-L270NNK的序列为tataMNNggtcggggccagcatcg，所述引物f-N311F313NNK的序列为catggttNNTtttNNTcaaatgggcagcggctgcacccgtgaaaac，所述引物r-N311F313NNK的序列为catttgANNaaaANNaaccatggtgaattcttccaggtgttctttg，所述引物f-W382NNk的序列为ccgNNKattggcgcgggttttggcctggaac，所述引物r-W382NNk的序列为caatMNNcggtttatcaatgccccattcac；

S14：以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-L260NNK和引物r-L260NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S15：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S16：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S17：以所述突变库3为模板，以所述引物f-W382NNk和引物r-W382NNk为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S18：将所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4混合，获得用于NBDK筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。

2.如权利要求1所述的基于NBDK的定点荧光标记方法，其特征在于，所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照1:1:32:1的比例进行混合。

3.如权利要求1所述的基于NBDK的定点荧光标记方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：

S21：取4-氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑(NBD-Cl)和赖氨酸，溶于乙酸乙酯和水的混合液中，并加热到30℃，滴加十六烷基三甲基溴化胺，反应2小时后即可得到NBDK1；

S22：取NBDK1经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到NBDK2，所述NBDK2经过0.22微米滤膜过滤除菌，获得NBDK。

4.如权利要求1所述的基于NBDK的定点荧光标记方法，其特征在于，所述NBDKRS的突变位点为L260G,L270A,N311A,N313G,W382C。

5.如权利要求1所述的基于NBDK的定点荧光标记方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：

S41：共转化NBDKRS-pBK和Myoglobin-4tag-pBAD至TOP10中；

S42：获得纯化的Myoglobin蛋白质；

S43：将S42中获得Myoglobin蛋白质在550nm激光激发下，发出红色荧光，即可验证筛选得到的NBDKRS能够实现目的蛋白的红色荧光标记。