[发明专利]食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型

权利要求书

1.食品中铅对人体的生物利用率及毒性的联合评价模型，其特征在于，包括肠黏膜上皮 细胞、肝细胞以及由微孔膜分隔成顶侧室和基底侧室的容器，肠黏膜上皮细胞培养在顶侧室 中，肝细胞培养在基底侧室中。

2.如权利要求1所述联合细胞模型，其特征在于，所述顶侧室为包含有微孔膜的 Transwell插入式细胞培养皿，基底侧室为细胞培养板，Transwell插入式细胞培养皿安装在细 胞培养板的培养孔中。

3.如权利要求1所述联合细胞模型，其特征在于，所述肠黏膜上皮细胞包括Caco-2细 胞和HT29-MTX细胞，所述肝细胞为QSG7701肝细胞。

4.如权利要求1所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)肠黏膜上皮细胞培养

将Caco-2细胞与HT29-MTX细胞共培养于六孔板的Transwell插入式细胞培养皿中，形 成肠黏膜上皮细胞单层，

(2)肝细胞培养

将QSG7701肝细胞培养在另一块六孔培养板中，

(3)联合评价模型的建立

将载有Caco-2细胞和HT29-MTX细胞的Transwell插入式细胞培养皿置于培养QSG7701 细胞的六孔板之上，即可。

5.如权利要求4所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：

将Transwell插入式细胞培养皿放入六孔培养板中，Caco-2细胞和HT29-MTX细胞按9： 1混合得到混合细胞悬液，将1.5ml密度为1×10⁵个/ml混合细胞悬液接种于Transwell插入式 细胞培养皿中，同时，在基底侧室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培养液，其中胎 牛血清的体积分数为10％；再置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培 养18～21天，期间每天更换基底侧室中的培养液，得到载有细胞跨膜电阻值大于等于 250Ω·cm²的肠黏膜上皮细胞的Transwell插入式细胞培养皿。

6.如权利要求4所述联合评价模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：

取另一块六孔培养板，每孔加入2ml细胞密度为1.5×10⁵个/mL的QSG7701肝细胞液， 采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培养基，其中胎牛血清的体积分数为10％，然后置于37 ℃、5％CO₂、相对湿度90％的恒温培养箱中连续培养3～5天，期间每天更换培养液，得载 有QSG7701细胞的细胞培养板。

7.一种利用如权利要求1所述联合评价模型评价食品中铅对人体的生物利用率及毒性的 方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备无菌食品待测液；

(2)将无菌食品待测液加入到所述联合评价模型的顶侧室的肠黏膜上皮细胞上，将HBSS 溶液作为转运溶液加入到所述联合评价模型的基底侧室的肝细胞上，再将所述联合评价模型 放入培养箱中培养；

(3)评价指标

①.分别检测肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液中的铅含量，根据检测结果评价待测食 品中铅对人体的生物利用率；

②.分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，检测肝细胞和转运溶液中乳酸脱氢酶活 性，根据检测结果评价待测定食品中铅对肝细胞的毒性。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：

取待测食品，磨碎，加入pH1.5的胃蛋白酶，在37℃恒温水浴锅中消化2h；然后加入pH5.0 的胰酶和胆汁消化液，在37℃恒温水浴锅中消化2h；用固体NaHCO₃调节消化液pH值为 7.0～7.2，离心，收取上清液，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，获取无菌食品待测液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述联合细胞模型放入37℃、5％CO₂、 相对湿度90％的培养箱中培养24h。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：

①分别收集肠黏膜上皮细胞、肝细胞和转运溶液的样品，各个样品分别经过体积比为的 4:1硝酸-双氧水消解，采用电感耦合等离子体质谱技术分别检测各个样品中铅含量，并通过 下式计算铅的生物利用率：

铅的生物利用率(％)＝(肠黏膜上皮细胞铅含量+肝细胞铅含量+转运溶液铅含量)/ 食品中铅含量×100％

②分别收集基底侧室中肝细胞和转运溶液样品，每孔肝细胞中加入细胞裂解液100μL， 于4℃静置15min后离心10min，收集细胞裂解液，采用乳酸脱氢酶试剂盒分别测定细胞 裂解液和转运溶液中的乳酸脱氢酶活性，根据乳酸脱氢酶漏出率评价待测定食品中铅对人体 的毒性，乳酸脱氢酶漏出率的计算式如下：

乳酸脱氢酶漏出率＝转运溶液中乳酸脱氢酶活性/(转运溶液中乳酸脱氢酶活性+细 胞裂解液中乳酸脱氢酶活性)×100％。