[发明专利]一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用，所述褐藻裂解酶的成熟蛋白包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其前体蛋白包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。所述褐藻裂解酶性质稳定，比酶活高达4600U/mL以上，可将褐藻胶酶解为具有特殊生物学活性的小分子褐藻寡糖，具备工业应用的潜质。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用。

背景技术

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-1,4-mannuronic acid，简称M)和其5位差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-1,4-guluronicacid，简称G)以C-1,4糖苷键非均聚形成的线性分子。，分子内聚M段、聚G段和M/G混合段交替排列。通常，褐藻胶由海带、马尾藻等食用型褐藻加工制得。铜绿假单胞菌、棕色固氮菌等微生物能分泌具有乙酰基修饰的褐藻胶。

研究发现褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有抗肿瘤、抗凝血、增强植物抗逆性、促进肠道内双歧杆菌生长等众多生理活性，其功能评价和开发研究得到不断深入，活性及药用价值研究已经成为新的热点。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻寡糖有多种方法制备，如酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法等。褐藻胶裂解酶作为工具酶酶解生产褐藻寡糖和低分子量多糖具有降解条件温和，过程可控，得率高等优点，已逐渐取代传统的酸解方法而成为褐藻寡糖生产的主要方式。此外，褐藻胶裂解酶可以作为工具酶用于褐藻胶精细结构的分析，海藻单细胞及原生质体的制备，治疗囊性纤维化(CF)患者的肺部感染及生产生物燃料等。褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化降解褐藻胶单体间的1,4糖苷键，在C4，C5之间形成不饱和双键，并伴随4-O-糖苷键的消除，且在还原端生成4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyl uronic acid。褐藻胶裂解酶按其降解褐藻多糖作用方式的不同在EC数据库中被分为多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和α-L-1，4-古洛糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)。

CN 102994407 A公开了一种内切褐藻胶裂解酶Alg2A的基因序列及其制备方法与应用。该发明所涉及的褐藻胶裂解酶Alg2A来源土壤新分离菌株Flavobacterium sp.S20。该发明还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Alg2A，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。CN 104293754 A公开了一种内切型褐藻胶裂解酶及其编码基因与应用，内切型褐藻胶裂解酶AlgL-5，所述的褐藻胶裂解酶AlgL-5降解褐藻胶过程中寡糖主产物包括不饱和二糖、不饱和三糖、和不饱和四糖不饱和五糖。酶的最小不饱和寡糖底物是五糖，最小不饱和寡糖产物是二糖。但是这两种酶的活性不够高，底物专一性差，无法实现产业化生产。

在自然界中能够产生褐藻胶裂解酶的生物分布广泛，已报到产褐藻胶裂解酶的物种有海洋软体动物、棘皮动物、细菌、真菌等,其中对细菌产褐藻胶裂解酶的研究最多。目前褐藻胶裂解酶的产品开发依然面临不安全、酶活力较低、酶稳定性差、酶的底物谱窄等问题。因此，筛选酶活力高、酶活稳定、产酶量高的褐藻胶裂解酶具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用，所述褐藻胶裂解酶活性好，底物专一性好。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种褐藻裂解酶，所述褐藻裂解酶包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。