[发明专利]一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法

说明书

本发明公开了一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁二酸三步骤，厌氧发酵采用电化学发酵，在发酵培养基中添加电子载体，并在阴极施加相应的电压值，所述电子载体的浓度为0.01‑0.5 mmol/L。所述电子载体为中性红或者核黄素。在阴极施加的阴极电压值通过循环伏安法在‑0.1V到1V之间进行扫描确定，扫描速度为5‑10 mV/s。厌氧条件下于电化学装置中发酵时，在电子载体的协助下胞内NADH总量有所提高，胞内还原力（NADH/NAD⁺）水平增加了2倍多，丁二酸积累量达到15.06g/L，有利于还原型产物丁二酸的高效合成。

技术领域

本发明涉及一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

对于不同碳源和产物而言，还原力供给和消耗水平并不总是一致，如1分子葡萄糖和1分子甘油经糖酵解途径转化为磷酸烯醇式丙酮酸时，均产生2分子NADH，若终产物为还原性较强的丁二酸或乙醇，当以葡萄糖为唯一碳源时，用于产物合成的还原力明显不足，降低了还原性产物的收率，而以甘油为碳源时，又会因为还原力过剩，菌体生长停滞。为了平衡胞内辅酶代谢，恢复菌体生长的同时增加还原型产物的收率，基因工程改造的方法最先被使用。Sánchez等（ Journal of Biotechnology, 2005, 117(4): 395-405）通过在大肠杆菌内过量表达来自酵母菌菌株的甲酸脱氢酶，增加了胞内NADH总量，还原性产物乙醇的量明显增加，同时副产物积累量有所减少。

随着代谢工程和合成生物学的迅猛发展，通过对宿主细胞进行基因工程改造，可以极大地促进目标代谢产物的合成，增加产量和收率。但是，在改造的同时，细胞的原有代谢途径受到影响，代谢不平衡会阻碍目标代谢物产量的进一步提升，尤其是还原型产物合成过程中辅酶不平衡的问题。通过引入辅酶相关代谢途径，如引入1,3-丙二醇或NAD⁺合成途径以降低胞内还原力水平，或以还原性较高的底物为碳源以增加胞内还原力水平，均可以在一定程度上调控胞内的辅酶平衡。但是代谢工程改造的同时会增加菌体的代谢负荷，对菌体生长及产物合成造成负面影响。

在电化学系统中，通过对阴阳两级或阴极施加某一特定的电压，体系中游离的电子载体可以从阴极电极获得电子被还原，处于还原态的电子载体会通过某种方式进入细胞周知空间，释放电子用于胞内代谢及NADH的再生，增加胞内的还原力水平。这样既可以避免因基因工程改造引起的菌株生长问题，又可以增加胞内还原力的供给。曹占平等（化工学报，2012，63(12)：4042-4047）通过电化学系统辅助微生物降解五氯酚时发现，电化学辅助微生物体系中存在着细胞与电极之间的电子传递，胞内NADH的增多有利于五氯酚的降解。

但是，不同的代谢物所需的还原力以及所需的电化学调控手段存在差异。在2,3-丁二醇的合成过程中，供给还原力的同时应该考虑电子及辅酶代谢平衡对细胞生长的影响，而对于1,4-丁二醇，增加了的还原力在很大范围内并不会导致胞内辅酶代谢不平衡现象，反而是越多的还原力越有利于其合成（Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 575-592）。因此，必须根据目标代谢产物的性质和合成途径，将增加了的还原力水平控制在一定的水平，在提高还原性产物收率的同时，又不会因还原力过高而抑制细胞的生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，将电化学系统引入微生物发酵体系中用于调控胞内辅酶平衡，包括增加还原力总量(NAD(H))及平衡辅酶代谢（NADH/NAD⁺），在不达到抑制细胞生长阀值的情况下，提高产物丁二酸的产量。

为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案如下：