[发明专利]联产丁醇与2;3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了联产丁醇与2,3‑丁二醇的基因工程菌，它是导入了乙偶姻还原酶基因的产丁醇梭菌或者导入了乙酰乳酸脱羧酶基因和乙偶姻还原酶基因的产丁醇梭菌，所述的乙酰乳酸脱羧酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1～7所示核苷酸序列中的任一种，所述的乙偶姻还原酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8～11所示核苷酸序列中的任一种。本发明通过在丙酮丁醇梭菌中强化乙酰乳酸脱羧反应，将3‑羟基丁酮产量由初始1.8g/L左右大幅提高到6.4g/L左右，进而在乙偶姻还原酶的作用下将乙偶姻转化为高达8.05g/L的2,3‑丁二醇；而丙酮由4.5g/L左右降低至2.2g/L，显著提高了丙酮丁醇梭菌发酵的经济效益。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种联产丁醇与2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

2,3-丁二醇是一种无色、无嗅的液体，具有较强的吸湿性。常温下为液体，黏度30.6mPa·s，沸点为178～182℃，冰点为-60℃，与水互溶，溶于乙醚、乙醇，在聚合体合成中用作单体。2,3-丁二醇是一种重要的生物基四碳平台化合物，广泛用于食品、化工、航空航天燃料等领域。

2,3-丁二醇生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类，化学合成法是利用化石原料生产2,3-丁二醇成本高，且条件苛刻、过程繁琐，容易对环境造成污染，而化石原料日益枯竭，因此化学合成法工业化生产较困难；生物转化法是利用可再生资源生产2,3-丁二醇，生物法既克服了化学法生产的原料问题，又符合绿色化工的要求，因此受到了人们越来越多的关注。目前2,3-丁二醇高产菌株主要是Klebsiella、Enterobacter和Serratia属的菌株，然而这些菌株具有潜在致病性，不符合工业化安全生产的要求。而目前报道的安全菌株如B.subtilis合成2,3-丁二醇的效率太低。

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，是目前生产丁醇的主要菌种。其发酵产物除丁醇外，还有丙酮和乙醇，因此在生产中又被称为ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)发酵。通常，60g/L的葡萄糖经丙酮丁醇梭菌发酵可产生12g/L的丁醇，6g/L的丙酮以及2g/L的乙醇，丁醇:丙酮:乙醇的比值为6:3:1(w/w)。在丙酮丁醇梭菌中导入乙酰乳酸脱羧反应酶和乙偶姻还原酶后，除ABE产物外，丙酮丁醇梭菌还会产生不少量的2,3-丁二醇。更重要的是，2,3-丁二醇生产过程中会有还原力(NADH或NADPH)的产生，在2，3-丁二醇的专性生产菌株中，这些还原力需被O₂氧化的方式实现NAD⁺的再生，从而造成还原力的浪费。而丙酮丁醇梭菌中丁醇合成过程恰恰是一个缺乏NAD(P)H的过程，以致丁醇发酵中有大量的氧化态副产物丙酮的生成。因此，在丙酮丁醇梭菌中构建2,3-丁二醇合成途径，能够利用2,3-丁二醇合成过程中产生的还原力补偿丁醇合成过程所需的还原力，从而在NAD(P)H代谢平衡的基础上以丙酮为代价生产2,3-丁二醇。

提高丙酮丁醇梭菌的2,3-丁二醇产量有以下几方面的意义:

(1)提高传统ABE发酵的经济效益。目前丁醇价格约1.1万元/吨，丙酮0.8万元/吨，乙醇0.55万元/吨。按照3吨糖产1吨溶剂来算，ABE发酵的产品价值只是略高于原料(约3200元/吨糖)，使得生物法生产ABE经济效益很差。然而2,3-丁二醇价格较高，市场价格约10万元/吨。因此提高ABE发酵中的2,3-丁二醇产量将显著提高ABE发酵的经济效益。