[发明专利]一种治疗肝硬化的基因药物及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗肝硬化的基因药物，其特征在于，其活性成分是以腺相关病毒为出发载体 构建的携带有表达基质金属蛋白酶的重组腺相关病毒载体。

2.根据权利要求1所述的一种治疗肝硬化的基因药物，其特征在于，所述腺相关病毒为 2型腺相关病毒，包括AAV2/1、AAV2/2、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8和 AAV2/9。

3.根据权利要求1所述的一种治疗肝硬化的基因药物，其特征在于，所述基质金属蛋白 酶包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14和MMP- 15。

4.根据权利要求3所述的一种治疗肝硬化的基因药物，其特征在于，所述基质金属蛋白 酶为其活性结构域部分。

5.一种如权利要求1所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，包括步 骤：

A、构建重组质粒：采用EcoRI和BamHI对AAV载体进行双酶切，将酶切后的AAV载体与 合成的编码基质金属蛋白酶的核苷酸序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4DNA连接酶 buffer溶液，制得重组质粒；

B、重组质粒的转化：将重组质粒向感受态DH5α细菌中转化，阳性克隆质粒即为携带有 表达基质金属蛋白酶的重组质粒；

C、重组腺相关病毒的包装：将携带有表达基质金属蛋白酶的重组质粒、脂质体、和辅助 包装质粒混合均匀后，加入到293T细胞培养皿中培养，制得表达基质金属蛋白酶的重组腺 相关病毒。

6.根据权利要求5所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，所述步骤A 中：

与AAV载体进行重组的核苷酸序列为MMP序列，MMP活性结构域序列，不同型号的MMP串 联序列或者不同型号的MMP活性结构域串联序列。

7.根据权利要求6所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，当AAV载体 与不同型号的MMP串联序列或者不同型号的MMP活性结构域串联序列进行重组时，所述不同 型号的MMP串联序列之间或者不同型号的MMP活性结构域串联序列之间用IRES序列隔开。

8.根据权利要求5所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，所述步骤C 具体包括：

C1、复苏293T细胞进行培养，待细胞长满后按照1:2传代至培养皿中，在病毒包装前2~5 小时，将培养皿中的培养液换成新的不含双抗的包含10%FBS的DMEM高糖完全培养基，待用；

C2、将携带有表达基质金属蛋白酶的重组质粒20μg、脂质体50μl、和辅助包装质粒10μg 混合均匀，常温放置15分钟后，加入到上述待用细胞培养皿中培养，六小时后换液；

C3、继续在细胞培养箱中培养72~80小时，收集上清液，过滤、离心，最后制得表达基质 金属蛋白酶的重组腺相关病毒。

9.根据权利要求8所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，所述步骤C3 中，细胞培养箱的温度设置为37℃，CO₂浓度为5%。

10.根据权利要求8所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其特征在于，所述步骤 C3中，采用0.44μm的滤器过滤病毒液。