[发明专利]一种增加有效细胞融合的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种增加有效融合细胞的方法。

背景技术

在常规的免疫，细胞融合中，因为针对目的抗原的浆细胞数目少，使得融合中大量的无意义B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，简写SP2/0)进行融合，增大了筛选目的细胞工作量，影响目的细胞株的获得，同时，在自然情况下，目的细胞株与杂细胞株竞争中，目的细胞株往往处于弱势，因而，通过一次融合得到目的细胞株很少甚至于没有。这就增加了免疫次数，延长了实验时间，不利于动物保护，增加了细胞融合获得有效细胞株的成本。奥韦赫罗实验室在2012年申请的专利200980160301.8，中间苍白杆菌的脂多糖及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途。该专利方法虽然有助于免疫获得良好的效果，但是其用途主要在于作为佐剂，而对于如何增加融合后筛选获得较多的有效细胞株并没有给予技术方案，因此，需要改进细胞融合方法。本发明人据脂多糖(LPS)等具有使B淋巴细胞、T淋巴细胞非特异性增殖的效果进行试验，并得到较好的效果，以此深入研究具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计细胞融合后获得更多目的细胞株的方法。

本发明提供一种增加有效融合细胞绝对量的方法。

该方法包括下列步骤：

(一)、测定实验动物对LPS的免疫剂量:

1)配制10mM磷酸盐缓冲液(PBS)

十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，溶解于1L纯化水中，在25℃下测定pH，以氢氧化钠、盐酸调pH至4.0-10.0，优选6.8-8.0，最优选7.0-7.4；

2)取6支eppendorf管，编号1-6，取LPS用PBS按照0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml稀释

3)将稀释后的溶液经0.22μm无菌滤膜(来自corning)过滤除菌,收集滤液；

4)每只小鼠注射0.01-0.5ml上述无菌滤液，并同时3组平行试验；

5)观察小鼠状态，记录各剂量试验小鼠的反应、状态，测定脂多糖免疫剂量；

结果见表1。

表1：不同剂量LPS刺激下小鼠状态记录表:

6)试验分析，从上表可以看出脂多糖每只免疫剂量在0.01mg-0.8mg范围内时，可以观察到较为明显的免疫反应(如毛发光亮度变差，体温升高等)。

(二)、实验动物抗原免疫效果的监测：

常规小鼠免疫，并在免疫后3-5天内进行断尾采血、离心10000g(g为离心力)、4分钟，取上清用PBS梯度稀释，进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定效价；

(三)、LPS对达到免疫条件的实验动物进行刺激免疫；

1)当抗原免疫效价达到500-60万，优选2000-40万，最优选2-10万时，进行加强免疫：取抗原(5-100μg)溶解于200μl PBS中，混匀后腹腔注射(10-200μl/只)；并在加强免疫的同时对小鼠注射LPS液:剂量为0.005-0.3mg/只，优选为0.08-0.12mg/只，最优选为0.1-0.15mg/只，观察小鼠情况；

2)融合前24小时再次对小鼠注射LPS液：剂量为0.05-0.4mg/只,优选为0.08-0.12mg/只，最优选为0.1-0.15mg/只；注射方法为腹腔注射或静脉穿刺，优选静脉穿刺；

3)小鼠经步骤2)注射LPS液24小时后融合：

Ⅰ取小鼠脾脏研磨，加含1％双抗DMEM培养基(双抗为链霉素、青霉素，购自gibco公司100倍母液，含1％双抗的DMEM培养液即为用DMEM稀释双抗母液100倍，如配制100ml含1％双抗的DMEM培养液：取1ml双抗母液，再加入99ml DMEM即可)1000g离心7分钟，2-3次，计数；

Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14，每次加DMEM1000g离心7分钟，2-3次，计数；

Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照1:2-1:10的比例混合；

Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；

Ⅴ在5s-90s内缓慢加入0.2-2.0ml聚乙二醇，分子量为3000-6000，优选为4000-5000，并轻轻搅拌，加入PEG时间控制30-60S,优选为40-50S，加入PEG的量为0.5-1.5ml，优选为0.8-1.2ml；