[发明专利]一种快速检测玉米组织中三种苯并噁嗪类防御物质的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用高效液相色谱快速且同时分析玉米组织提取物中三种苯并噁嗪类化合物的检测方法，属于植物化学分析领域。

背景技术：

苯并噁嗪(Benzoxazine)是禾本科作物中普遍存在有抗虫，抗菌效应的一类次生代谢产物，其中化合物2,4-二羟基-1,4-苯并噁嗪-3-啉酮(DIMBOA)、2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-啉酮(DIMBOA)和6-甲氧基-2-苯噁唑啉酮(MBOA)是玉米中最为主要的苯并噁嗪类防御物质，对害虫和病原菌有明显的防御作用。如玉米根系和叶片中的DIMBOA分别可以影响玉米根叶甲(Diabrotica virgifera)和灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)的生长发育，并对害虫具有致畸效应。玉米叶片中的DIMBOA可以抑制玉米大斑病菌的孢子萌发和菌丝的生长。目前，DIMBOA在玉米种的合成代谢途径已大致清晰，DIBOA是DIMBOA合成的直接前体，而MBOA则是DIMBOA降解的直接产物。目前，有报道利用乙醚萃取的方法提取玉米植株中的苯并噁嗪类化合物，且利用1％的甲酸或冰乙酸作为流动相(A)，1％甲醇作为洗脱相(B)，在不同的浓度梯度洗脱条件下，流动相(A)：0min，70％；2min，70％；19min，40％；21min，0％；洗脱相(B)：0min，30％；2min，30％；19min，60％；21min，100％；DIMBOA的出峰时间在10min，而MBOA的出峰时间则在16min，而流速为1mL/min，进样量为50μL，色谱柱温为25℃，检测波长为260nm，进行DIMBOA和MBOA的检测。该检测方法的持续时间较长，而且在提取过程中DIMBOA于水中或光照条件下易分解，影响试验进程及结果，不能真实地反应出DIMBOA在植物体内的含量。另外，有关玉米植株体内DIBOA的检测未见报道。

因此，迫切需要建立一种可以快速提取并同时检测DIBOA、DIMBOA和MBOA的方法，用于玉米植株体内苯并噁嗪类化合物的快速定量检测，为玉米抗病虫资源的评价提供技术支撑。

本发明提供一种利用高效液相色谱快速且同时检测玉米组织提取物中三种苯并噁嗪化合物(DIBOA、DIMBOA和MBOA)含量的方法，经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中苯并噁嗪提取和检测方法易降解、耗时的不足，而提供一种利用高效液相色谱快速且同时检测玉米组织提取物中三种苯并噁嗪化合物(DIBOA、DIMBOA和MBOA)含量的方法。

本发明是这样实现的：

1、玉米样品的提取：取玉米的根或叶片于液氮中磨碎至粉末状；将粉末置于15mL预先加入5mL乙酸乙酯的样品管，混匀后放置60min，期间混匀3次；恢复至室温的萃取液在振荡器上涡旋震荡2分钟呈悬浮状；上述悬浮液经双层灭菌滤纸过滤于100mL心形旋蒸瓶中，用5mL乙酸乙酯冲洗2次，共15mL滤液；滤液经旋转蒸发仪于40℃旋蒸至干燥状，然后用500μL甲醇充分溶解后置于1mL棕色样品瓶中，密封保存于-80℃；

2、样品检测：采用Agilent 1200高效液相色谱仪和Extend C18100×4.6mm色谱柱进行检测。取1mL磷酸溶入999mL的灭菌水配置成0.1％的磷酸作为流动相(A)，而将100％甲醇作为洗脱相(B)进行浓度梯度洗脱；流动相(A)：0min，80％；10min，30％；10.5min，0％；洗脱相(B)：0min，20％；10min，70％；10.5min，100％；流速为0.5mL/min，色谱柱温为30℃，进样量为5μL，检测波长为254nm。出峰时间则为：DIBOA 7.420min，DIMBOA 8.186min，MBOA 9.747min。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的样品提取方法有效降低了提取液中DIMBOA降解为MBOA的速率，能比较真实地反应玉米植株体内DIMBOA的含量。

2、本发明的检测方法能够同时检测玉米根系或叶片组织提取物中DIBOA、DIMBOA和MBOA的含量，同时避免了样品洗脱时与水的接触机率，降低了DIMBOA降解为MBOA的速度，而且减少了色谱试验时间，为苯并噁嗪的化学定量分析提供了一种简便有效的方法。

附图说明：

图1为DIBOA、DIMBOA、MBOA标准品以及待测样品高效液相色谱图。

图中：A.DIBOA标准品；B.DIMBOA标准品；C.MBOA标准品；D.样品。