[发明专利]一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，具体是一种绿色木霉突变株的发酵方法及应用。

背景技术

绿色木霉在木霉属中是一种较为理想的抗土传病的半知菌，不仅效果快，且抗菌的广 谱性强，还具有一定的促作物生长之作用。尤其是对防治土壤中的立枯病和赤霉病均有快 而显著的作用，当上述病害发生时，既可以迅速控制病情，也可在作物种子播撒时拌入种 子起到防疫作用。此外还可以对作物的营养利用、环境温度及光等环境因子适应方面发挥 良好作用。因此，在了解它的生物学作用的基础上，筛选出适合于它生长并合成发挥生物 学抑菌作用的产物，应用于减少作物病害、促进作物生长、为人畜提供安全健康的食物具 有重要意义。

近年来(2007年～2014年)黑龙江林业职业研究院孙永琴通过绿色木霉对栽培黑木 耳的危害研究产生的生物学特性及防治，王春等人从向日葵菌核病筛选出对菌核病菌生长 及其菌核病萌发有关抑制力的生防绿色木霉菌株，对有关病菌孢子萌发抑制和离体叶片的 防效分别达90％以上、80％以上，并发现培养该生防绿色木霉菌株具有良好的生产性状和生 防效果。其机制即在于将所筛选分离的野生绿色木霉经诱变筛选的第二次纯化菌物经进一 步扩大培养(即发酵)，形成大量孢子体或菌丝体，再适当加入添加剂制成颗粒剂、粉剂， 使之便于拌入种子一起播入土壤中，当下雨或土壤湿度适当时即萌发，通过分解土壤有机 质(如作物秸秆)，其菌丝沿异源菌体缠绕并分泌细胞产物将异源菌物杀死，或抑制其他 杂菌生长，保护农作物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、效率高、无污染的绿色木霉突变株的发酵方法及 应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种绿色木霉突变株的发酵方法，包括以下步骤：

(1)液体发酵，包括以下步骤：

11)菌株的活化：将经秋水仙碱化学诱变的绿色木霉突变株接种到PDA培养基上培养 5～7天，使其菌物活化并适应发酵的新环境；

12)活化后菌株的孢子悬浮液培养：取活化后的菌株，接种培养于可在显微镜下显示 孢子成熟，用10ml无菌水冲洗活化后的孢子至150ml无菌三角瓶中，然后在恒温摇床上 以120r/min振荡20min，使孢子团充分分散后，用血球计数器计数，再以1×10⁸个/ml的 接种量接种于一定体积并装有液体培养基的发酵罐中发酵5～7天，得到活化后菌株的孢 子悬浮液；在发酵过程中，用0.10～0.25molNaOH调节pH于4.3～6.5之间；

(2)固体发酵，包括以下步骤：

21)固体发酵培养基料准备：按照质量百分比计，由碳素38％、氮素4％、磷酸盐矿质 元素1％、石碳粉22％、水25％和菌物10％组成；所述的碳素源自含水率均＜10％的甘蔗渣、 作物秸秆粉、麦麸、玉米壳粉、碎米糠中的一种或两种以上的混合物；所述的氮素包括无 机氮源和有机氮源，无机氮源为尿素、(NH₄)NO₃、NaNO₃、亚硝酸钠和硫酸铵中的一种或 两种以上的混合物，有机氮源为蛋白胨、鱼粉和血粉中的一种或两种以上的混合物；所述 的磷酸盐矿质元素为KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、(NH₄)₂HPO₄和(NH₄)H₂PO₄中的一 种或两种以上的混合物；所述的菌物源自步骤(1)中的活化后菌株的孢子悬浮液；所述 的血粉的配制：收购集贸市场宰杀后的动物血，倒入蒸煮锅的沸水中，3min即捞出沉淀， 粉碎风干或烘干再打成粉末，即为血粉；

22)固体发酵：将碳素、氮素、磷酸盐矿质元素、石碳粉按上述比例组合，经充分搅 拌，于蒸煮锅或消毒罐在1.13个大气压下高温消毒30min，出料，冷至室温后，按比例加 入步骤(1)中活化后菌株的孢子悬浮液，经充分拌匀后，转入大型发酵罐控温发酵5～7 天，发酵温度在28±0.5℃，冷风吹干包装，即得绿色木霉突变株的发酵产物。