[发明专利]检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测植物中辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法，具体而 言，涉及一种特异性检测茄科植物中的辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法。

背景技术

辣椒叶脉黄化病毒(Pepperveinyellowsvirus，PeVYV)，是一种新型的黄症病 毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)病毒。PeVYV目前主要侵染的作物是 辣椒，在同属茄科植物龙葵上也有报导，经常在混合感染中发现，是一个引起脉黄病 (yellowveindisease)的重要的病原体，在西非地区是一种主要的辣椒病害。PeVYV是通 过棉蚜、嫁接等持续的方式传播，在辣椒上的症状主要有植物矮化、叶脉黄化、叶卷曲、叶片 变形、叶褶皱和节间缩短等。自1995年在日本首次确定以来，PeVYV在欧洲(包括西班牙、荷 兰和土耳其)，亚洲(中国、中国台湾、泰国、印度、印度尼西亚、菲律宾和日本)和非洲(苏丹、 马里和突尼斯)等地区都有数据报导。这表明，PeVYV具有广泛的地域分布，对辣椒和其他茄 科植物构成了一个全球性的威胁。

目前，尚未有专门检测PeVYV的专利报导，譬如酶联免疫吸附法以及实时荧光RT- PCR等分子生物学检测方法并未见报导。这对PeVYV的检测来说，是一个重大的缺失，必然对 辣椒感染PeVYV的诊断及及时防控带来负面的影响。而辣椒上PeVYV的发生一般伴随着其他 病毒(比如TMV、CMV、BBWV、PVY等)的混合感染，而且PeVYV侵染发生的某些症状和其它病毒 病的感染症状类似，因此很难简单地从症状上进行区别鉴定；同时，在实验室条件下利用显 微技术对病毒粒子进行形态观察并不能做到有效精准地判断。在这种形势下，建立一种快 速、准确的检测辣椒中PeVYV的PCR方法是非常有必要的，而在这个方法中最关键的是找到 针对PeVYV的特异性高的PCR引物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种检测辣椒叶 脉黄化病毒的RT-PCR引物及其方法，利用本发明的RT-PCR引物及方法能更快速、更准确地 直接检测出辣椒或龙葵中是否含有辣椒叶脉黄化病毒。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：一种检测辣椒叶脉黄化病毒的 RT-PCR引物，其正向引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明同时还提供一种检测辣椒叶脉黄化病毒的RT-PCR方法，该方法是提取待测 样品总RNA，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行电泳鉴定，当所述扩增 产物大小为504bp时，则判断该待测样品感染了辣椒叶脉黄化病毒。

所述待测样品为茄科植物辣椒或龙葵。进一步地，所述待测样品是辣椒叶片或龙 葵叶片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明中设计的特异引物是根据PeVYV核苷酸序列的高保守区所设计，与其它引 物相比较，除了特异性好之外，还具有对不同的PeVYV分离物覆盖率最高的特点，能有效检 测到不同的PeVYV分离物，检测结果更加准确，且检测时不需加辅助引物，更加方便。本发明 的检测方法适用于大批量辣椒作物叶子中PeVYV的直接检测，在降低了检测成本，减少了工 作量的同时，保留了快速、准确，以及灵敏度高等优势。

附图说明

图1是PeVYV正反向引物的Primer-BLAST结果。

图2为本发明正、反向引物与JX427532.1序列互补性对比图。

图中，A：正向引物；B：反向引物。

图3为本发明正、反向引物两引物之间互补性对比图。

图4为本发明引物扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

图中，各泳道从左至右依次为TRANS2KPlusDNAMarker、携带PeVYV的辣椒叶 片、健康的辣椒叶片。

图5为本发明引物扩增电泳结果图。

图中，M：TRANS2KPlusDNAMarker；1：感染了PeVYV的辣椒病株叶片；2：感染了 PeVYV的辣椒病株种子；3：感染了蚕豆萎蔫病毒的辣椒病株；4：感染了小西葫芦黄花叶病毒 的南瓜病株。

具体实施方式