[发明专利]一种血红蛋白类携氧纳米凝胶及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种血红蛋白类携氧纳米凝胶的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)纳米凝胶mPEG-PEI-g-SH的制备：

将摩尔质量为5000g/mol的羧基聚乙二醇单甲醚mPEG-COOH溶于二氯甲烷，于室温及纯度大于97％的氮气流保护条件下，加入2倍摩尔量EDC·HCl反应0.5h后，再加入1倍摩尔量NHS反应2h，将上述反应溶液匀速滴加到摩尔质量为1800g/mol的支链PEI的二氯甲烷溶液中，40℃油浴中反应6-12小时后终止反应，待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冰石油醚中沉淀，将沉淀过滤，使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到mPEG-PEI；将mPEG-PEI溶解于0.1M的NaHCO₃溶液中，所述NaHCO₃溶液中含5mM的EDTA，在纯度大于97％的氮气流保护条件下，按照摩尔比1：1-10加入Traut’s试剂，反应12-24小时后终止反应，产物经透析纯化，再冻干即可得mPEG-PEI-g-SH；所述mPEG-PEI-g-SH中-SH的接枝率为30％，分子量为6620～6840；

(2)DBBF修饰的血红蛋白的制备：

A、取纯化血红蛋白，加入有机磷酸盐，加入具有缓冲能力的物质，调节其pH为6.0-8.0；

B、在低温下0℃-10℃，对血红蛋白溶液反复通氮气、抽真空的方法，进行脱氧；

C、加入DBBF，DBBF∶Hb为2.5∶1，在通氮条件下，反应温度为35℃～40℃，pH值为6.0～8.0，反应时间2.5小时，血红蛋白溶液浓度为50mg/ml；

D、用氨基酸中止反应，氨基酸与DBBF的摩尔比为2∶1，反应时间2小时；

(3)血红蛋白/结合珠蛋白纳米凝胶的制备：

称取700mg步骤(1)所得mPEG-PEI-g-SH溶解于0.1M Tris缓冲液，经抽真空通N₂后，在氮气流下加入0.1％DTT，反应2h后，于4℃加入步骤(2)制备的DBBF修饰的血红蛋白560mg，4℃避光搅拌反应6-12h后，用磷酸盐缓冲液洗涤后经超滤离心除去游离血红蛋白，直至洗涤清液在400-600nm区域无吸收为止，将所得载血红蛋白的纳米水凝胶分散于磷酸盐缓冲液，加入200μg结合珠蛋白，4℃避光振荡反应4小时，反应产物在10000g下冷冻高速离心分离，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述冰石油醚为在-20度冻4h以上的石油醚；

和/或，步骤(2)的步骤A中，所述有机磷酸盐为2、3-DPG类似物，预先用NaOH调节好，pH值为6.0～8.0的植酸，在血红蛋白溶液中的浓度为8mM/L；

和/或，步骤(2)的步骤A中，所述血红蛋白为人脐带血血红蛋白；

和/或，步骤(2)的步骤A中，所述具有缓冲能力的物质为Tris-HCl；

和/或，步骤(2)的步骤B中，所述脱氧方法为每间隔15min，通N₂，抽真空，通小流量N₂维持体系脱氧态；

和/或，步骤(2)的步骤D中，所述氨基酸是赖氨酸。