[发明专利]不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体地说，涉及不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法。

背景技术

肺炎链球菌肺炎或称肺炎球菌肺炎，是由肺炎链球菌或称肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)所引起的肺炎，通常急骤起病，以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征。在过去的两个世纪，没有几种传染性病原体在全球的发病率和死亡率可与肺炎链球菌相匹敌，每年导致全球一百万5岁以下儿童死亡。肺炎链球菌仍然是社区获得性肺炎的主要原因，在成人中主要引起大叶性肺炎，在儿童中常引发细菌性肺炎、脑膜炎、中耳炎、胸膜炎等疾病。在没有抗生素之前，约有70％以上因肺炎菌血症住院的病人死亡。婴幼儿中20-48％的急性中耳炎和50％的化脓性中耳炎是由肺炎链球菌引起的，菌血症感染会引起较高的死亡率。据估计，肺炎链球菌性肺炎在成人的发病率每年为0.1-0.47％,病死率为11％。我国肺炎发病率一直很高，近40多年来，其菌血症死亡率一直徘徊在25-29％之间，院外获得性肺炎中肺炎链球菌性肺炎可达46-76％。针对肺炎链球菌的感染，多年来一直采用抗生素治疗，然而目前耐药菌株多达96％以上，且呈现多重耐药性状。因此，开发疫苗以预防该菌引起的疾病至关重要。

已发现的肺炎链球菌有90多个血清型，是建立在荚膜抗原的微少差异及家兔免疫器官对荚膜化学成份之间的微小差异加以识别的，并产生对每种抗原的特异性抗体基础上进行分型的。肺炎链球菌的荚膜抗原是迄今为止细菌性疫苗中抗原结构最复杂的，其型特异性多糖是由许多重复结构单元组成的大分子聚合体，构成了胸腺非依赖性抗原(thymus-independent，TI)的特性。荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)即是细菌的毒性因子又是一种重要的保护性抗原。

利用化学方法纯化的细菌荚膜多糖制备组分疫苗是20世纪疫苗发展的重要成就之一，也是第二次疫苗革命的标志之一。在世界范围内广泛使用的多糖疫苗如流行性脑膜炎球菌A、C、Y、W135等4价多糖疫苗，肺炎23价多糖疫苗，伤寒Vi多糖疫苗等。大量临床试验结果表明，接种多糖疫苗引起的副反应十分罕见，这些疫苗对于预防成人和大龄儿童的相应感染方面效果显著。令人遗憾的是多糖疫苗在年幼儿童中产生的抗体亲合力低，对婴幼儿的效果甚微或根本无效。将细菌荚膜多糖与蛋白载体通过化学方式结合可以解决这个缺点，可将多糖胸腺不依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，从而启动T辅助淋巴细胞产生一系列的免疫增强效应，并产生免疫记忆应答；1987年B型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗的成功研制，开创了结合疫苗发展史上的又一个里程碑，结合疫苗成为儿童疫苗研究中的一个热点。随后国际市场上陆续出现了A+C、ACYW₁₃₅群脑膜炎结合疫苗和7价、10价、13价肺炎链球菌结合疫苗。其它各类含荚膜多糖或含脂多糖的细菌的结合疫苗也陆续上市。

由于肺炎链球菌荚膜多糖的分子量较大，导致多糖溶液的粘度也大，造成多糖活化、结合物制备和纯化等步骤难以操作。使用大分子多糖作为原料多糖将导致结合物过度交联、结合物的分子量过大，从而对产品的质量造成风险，可能使免疫效果变差。为改变荚膜多糖的分子量大的这种情况，在进行活化、结合工艺之前，对肺炎球菌荚膜多糖进行降解处理。

常用的肺炎球菌荚膜多糖降解方法有以下几种：1、乙酸降解法；2、三氟乙酸降解法；3、氢氧化钠降解法。

本发明采用过氧化氢法降解肺炎球菌荚膜多糖，并对该方法进行了改良，以获得相对分子量变小的肺炎链球菌荚膜多糖或寡糖，从而满足活化结合的工艺要求。

发明内容

本发明的目的是提供利用过氧化氢实现对不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖水解的方法。

为了实现本发明目的，本发明的不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解方法，包括：向不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水溶液中加入过氧化氢溶液与无机盐溶液对多糖进行水解，于50℃-80℃反应3-5小时，反应结束后，将含有不同大小多糖水解片段的反应混合物进行超滤浓缩，然后过Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，收集kD值0.2-0.65的分离峰，经超滤浓缩、冻干后得到不同血清型肺炎链球菌荚膜多糖的水解产物。

本发明所述的不同血清的型肺炎链球菌包括血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、9N、14、18C、19F、19A、22F、23F、33F。

本发明所述的无机盐包括硫酸锌、硫酸铜、硫酸镍、硫酸锰等；优选硫酸锌。