[发明专利]一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统，其特征在于，所述系统包括4种酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825；其中，pDH735携带的整合卡盒为：pTEF-attP1-ccdB-CAT-attP2-pTRP1-kan-tTEF；pDH818携带的整合卡盒为：pT-attP1-ccdB-CAT-attP2-pTRP1-kan-tTEF；pDH824携带的整合卡盒为：pTEF-attP1-ccdB-CAT-attP2-pADH1-nat-tTEF；pDH825携带的整合卡盒为：pT-attP1-ccdB-CAT-attP2-pADH1-nat-tTEF；

所述pDH735的构建方法包括：将质粒pDONR221中的attP1-ccdB-CAT-attP2分成上、下游两段分别克隆到pDH734的pTEF-pTRP1-kan-tTEF卡盒中，构建pTEF-attP1-ccdB-CAT-attP2-pTRP1-kan-tTEF整合卡盒，所获质粒即为pDH735；

所述pDH818的构建方法包括：将质粒pDH735中的attP1-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到质粒pDH817中，构建pT-attP1-ccdB-CAT-attP2-pTRP1-kan-tTEF整合卡盒，所获质粒即为pDH818；

所述pDH824的构建方法包括：将质粒pDH735中的attP1-ccdB-CAT-attP2卡盒克隆到质粒pDH823中，构建pTEF-attP1-ccdB-CAT-attP2-pADH1-nat-tTEF整合卡盒，所获质粒即为pDH824；

所述pDH825的构建方法包括：将质粒pDH818中的pT启动子及attP1-ccdB-CAT-attP2克隆到pDH823中，构建pT-attP1-ccdB-CAT-attP2-pADH1-nat-tTEF卡盒，所获质粒即为pDH825；

其中，质粒pDH734是在pFA6a-kanMX基础上，导入了含有EM7启动子及TRP1启动子的pTEF-pTRP1-kan-tTEF卡盒；pDH817质粒是在pDH734基础上改造得到，pT启动子仅含有pDH734上pTEF的前148bp的序列；将ADH1启动子克隆到pAG25中，构建pTEF-pADH1-nat-tTEF卡盒，所获质粒命名为pDH823。

2.一种如权利要求1所述的酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在于，应用于酿酒酵母的等位基因高效整合。

3.根据权利要求2所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在于，所述酿酒酵母的等位基因高效整合方法，包括：

(1)构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整合质粒；

(2)将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到步骤(1)中的质粒的整合卡盒中；

(3)针对基因敲除背景的酵母菌株，利用酶切将步骤(2)中的整合卡盒从质粒中释放出来，转入基因敲除背景的酵母菌株中进行同源重组替换原敲除基因座上的筛选标记基因，并筛选鉴定；

针对转入非基因敲除背景的酵母菌株，设计两对与内源靶基因同向和反向的引物，以携带相应靶基因的高效整合质粒为模板，利用PCR将携带有多个突变位点的靶基因的卡盒扩增出来，转入非基因敲除背景的酵母菌株中，同向或反向的替换酵母基因组上的内源靶基因，并分别通过PCR检测正确整合效率，同时检测靶基因多个突变位点，分析完整性。

4.根据权利要求3所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在于，所述步骤(2)中克隆方式为PCR克隆技术。

5.根据权利要求3所述的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统的应用，其特征在于，所述步骤(3)中基因敲除背景的酿酒酵母菌株的基因座上具有pTEF和tTEF侧翼的筛选标记基因；所述酶切采用限制性内切酶NotI；所述筛选标记基因包括URAMX；所述筛选为G418或NAT抗性培养基筛选；所述鉴定为转化子发孢子所产生的单倍体子代进行抗G418或NAT表型鉴定。